Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы белка, которые
не существенны для его функции (в нашем случае -катализа). С этой позиции
попытаемся выявить в белке группы-мишени, наиболее предпочтительные для
целей ковалентной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии.
Во-первых, группы-мишени должны быть высокореакциоиноспо-собными, чтобы
по возможности обеспечить избирательность реакции модификации, а также ее
протекание в мягких неденатурирующих условиях. Во-вторых, таких групп в
белке должно быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности
для введения новых химических связей в белковую молекулу с регуляцией их
числа и локализации и снизить таким образом вероятность модификации
активных центров ферментов. Данные о сравнительной реакционной
способности и относительному содержанию аминокислотных остатков приведены
на рис. 13..
Самыми реакционноспособными группами в белках являются SN-группы
цистеина. Они способны принимать участие в разнообразных химических
реакциях: окисления, анилирования, алкилирования и т. д. Однако
собственные тиольные группы бел-
84
ка не очень подходят на роль мишеней для ковалентной иммобилизации. Дело
не только в том, что содержание цистеина в белках в общем-то невелико.
Очень часто в белках вообще нет сво: бодных SH -групп: они участвуют в
образовании дисульфидных мостиков, стабилизирующих структуру ферментов. В
тех же случаях, когда такие группы в белке есть, они, как правило,
необходимы для каталитической активности. Тогда при иммобилизации
возникает задача защитить SH-группы. Решить ее можно различными приемами,
например обработкой белка п-оксимерку-рибензоатом: после окончания
иммобилизации защитная группа отщепляется в слабокислой среде. Несмотря
на указанные осложняющие обстоятельства использование SH-групп для
ковалентной иммобилизации ферментов остается привлекательным и в ряде
случаев может быть осуществимо. Разработаны также методы, позволяющие
вводить в молекулу белка экзогенные SH-группы, например, модификацией
аминогрупп белка подходящими реагентами, в частности ацилированией
'гиолактоном гомо-цистеина.
Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного рода
химических модификаций и для целей ковалентной иммобилизации ферментов.
Это обусловлено рядом причин. Во-первых, их в белке достаточно много (см.
рис. 13). Во-вторых, аминогруппы высокореакционноспособны и уступают лишь
SH-группам по числу и разнообразию реакций, в которых они могут принимать
участие. В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второстепенную
роль в поддержании структуры и функции ферментов. Важное свойство
аминогрупп - способность протонироваться (рК 9-10), обеспечивает в
физиологических условиях наличие на поверхности белков положительных
зарядов, которые взаимодействуют с противоионами из раствора или с
отрицательно заряженными карбоксильными группами белка, образуя в
последнем случае солевые мостики. Если для нормального функционирования
фермента важно сохранение положительного заряда, то этого можно достичь
при химической модификации аминогрупп, переводя их (алкилированием) из
первичных во вторичные. В-четвер-ты:?, если некоторые аминогруппы, а не
только их заряд, окажутся существенными для структуры и функции фермента,
то их при необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием
ангидридом трифторуксусной кислоты или малеиновым ангидридом (первая из
указанных защитных групп снимается в щелочной среде, а вторая - в
кислой). В-пятых, для ковалентной иммобилизации ферментов посредством их
аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и
сшивающих реагентов.
Таким образом, наиболее удобной группой - мишенью, следует считать
аминогруппу. Однако, чтобы не сложилось впечатление об уникальности
использования аминогрупп белков для целей ковалентной иммобилизации,
необходимо отметить, что (как правило) обычные химические реагенты
являются неспецифи-
85
ческими и, помимо аминогрупп, в реакциях модификации могут принимать
участие и другие функциональные группы белка, такие, как тиольные
(цистеина), имидазольные (гистидина), гуанидиновые (аргинина),
гидроксильные (тирозина, серина и треонина), а также небелковые
компоненты фермента или же реакционной системы, в частности вода.
Реакционная способность тех или иных групп белка существенным образом
зависит от условий: макро и микро. Группу макроусловий составляют такие,
как природа растворителя, рн среды, температура - эти условия могут и
должны быть строго контролируемыми. Микроусловия, микросреда
функциональной группы определяются структурой фермента, ее трудно
изменять в нативном белке, но важно учитывать при выборе метода и внешних
условий модификации.
В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть, что в целом белковые
структуры весьма лабильны и существует огромное количество факторов, в
том числе химических, вызывающих денатурацию и инактивацию ферментов.
