Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
состоит в том, что Змульсию водного раствора фермента в органическом
растворе волокнообразующего полимера (производные целлюлозы,
поливинилхлорид, поли-Г-метилглутамат) продавливают через фильеры в
жидкость (например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные
волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие
гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером
около 1 мкм (рис. 9, в). Ферментсодержащие волокна обладают высокой
механической прочностью; например, из них можно изготовить ткань, которая
будет обладать ферментативной активностью. Для дополнительного повышения
механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную
оболочку.
Для иммобилизации ферментов можно использовать также производимые
промышленностью готовые полимерные полые волокна, которые применяют для
очистки белков методом диализа (рис. 9, г). Полые волокна изготавливают
из природных или синтетических полимеров (целлюлоза, поливинилхлорид,
полисульфон, полиакриламид); они имеют внешний и внутрен-
70
ний диаметр порядка нескольких сотен микрометров при толщине мембраны в
несколько десятых микрометра. Для проведения ферментативной реакции
волокна, по которым циркулирует раствор фермента, погружают в сосуд с
раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокон.
§ 14. Включение в липосомы
Впервые липосомы были использованы для включения ферментов Дж. Сесса и
Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления
принадлежит также Г. Гре-гориадису. Существует несколько способов
получения липосом, содержащих включенный фермент (рис. 9, д). В одном из
иих раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе
(например, в хлороформе) упаривается в вакууме, и липид остается на
стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор
фермента, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и
оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида
происходит самопроизвольное образование (самосборка) мультиламеллярных
липосом, содержащих включенный фермент. Во избежание окисления липида все
операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.
В другом варианте метода раствор липида в органическом растворителе
наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего
органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа,
а образовавшуюся липидную пленку диспергируют в водном растворе.
Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим
растворителем может вызвать инактивацию фермента.
Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют
центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае
моноламеллярных липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки,
разделение проводят методом гель-фильтрации на колонке.
Ферменты, иммобилизованные путем включения в липосомы, применяются
главным образом в медицинских целях, а также при проведении
фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным
мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных
процессах в клетках.
Недавно был предложен новый способ иммобилизации ферментов путем
включения их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае
используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу
кратной связи (см. гл. 1). После включения фермента в липосомы,
приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их
подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора.
При этом происходит полимеризация мономерных молекул липи-
71
да с образованием ковалентно сшитой замкнутой липидной бислойной
мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой
стабильностью по сравнению с обычными.
§15. Преимущества и недостатки иммобилизации с использованием
полупроницаемых оболочек
К числу основных достоинств этого метода иммобилизации можно отнести его
простоту и универсальность (возможность включения не только
индивидуальных ферментов, но и поли-ферментных систем, клеток и клеточных
фрагментов, ферментов, предварительно иммобилизованных каким-либо иным
способом, и т.п.). Применение систем мембранного типа позволяет получать
иммобилизованные препараты с высоким содержанием включенного фермента;
например, в каждый грамм волокон, изготовляемых методом влажного
прядения, можно включить свыше 200 мг фермента. Иммобилизованные в
мембранных системах ферменты в значительной степени сохраняют свою
каталитическую активность, а их стабильность часто существенно
возрастает. Эффект стабилизации обеспечивается, в частности, за счет
исключения деградации ферментов под действием микроорганизмов, которые не
могут проникнуть сквозь мембрану. Кроме того, благодаря высокому
отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать
значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций.
