Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
§ 4. Недостатки и преимущества получения и использования ковалентно
иммобилизованных ферментов
При описании методов ковалентной иммобилизации после рассмотрения
основных химических приемов для их иллюстрации обычно приводят конкретные
практические методики. Дело в том, что объективный общий сравнительный
анализ различных методов крайне затруднителен, если вообще возможен,
поскольку ни одному из указанных в предыдущем разделе приемов не может
быть отдано абсолютное предпочтение. Накопленный экспериментальный
материал свидетельствует, например, о том, что использование одного и
того же метода в качестве стандартной процедуры приводит в случае
различных ферментов к резко отличающимся конечным результатам [уровню
остаточной актив-
95
ности и (или) стабильности]. Более того, характеристики получаемых
методами ковалентной иммобилизации ферментных препаратов существенным
образом зависят от исходного образца фермента (в частности, от процедуры
его выделения и очистки), природы носителя, чистоты используемых
реагентов и т. д. Не последнее место в этом перечне занимают личный опыт
и квалификация экспериментатора. В этой связи отметим, что те условия
реакций, которые были указаны в предыдущем разделе, ориен-
тировочны^^ороче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом
является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь,
умением экспериментатора (уровнем его научного мышления, способностью к
целенаправленному поиску оптимальных условий для реализуемого процесса).
Тем не менее одну общую рекомендацию к разработке процедуры химической
иммобилизации можно дать.
Напомним, что основная задача экспериментатора заключается в формировании
новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании
функциональных групп, не существенных для проявления его каталитической
активности. Следовательно, при химической модификации фермента его
активный центр желательно защищать - ковалентно или нековалентно. Для
этого можно употреблять обратимые ингибиторы, субстраты, различные
защитные реагенты. В ряде случаев для иммобилизации могут быть применены
каталитически неактивные предшественники ферментов, зимогены,
превращаемые в соответствующие ферменты после завершения стадии
ковалентной фиксации.
При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для
крупномасштабных процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и
дороговизны. Действительно, сегодня нельзя с достоверностью назвать ни
одного промышленного процесса с ковалентно иммобилизованными ферментами -
обычно в них используются те или иные методы физической иммобилизации.
Иная ситуация сложилась в лабораторной практике, где химические методы
иммобилизации занимают доминирующее положение. Без них немыслимы аффинная
хроматография, имму-ноферментный анализ, тонкий органический синтез особо
чистых препаратов и многие другие процедуры. Кроме того, в химической
сложности и гибкости методов ковалентной иммобилизации заложены широкие
возможности создания препаратов иммобилизованных ферментов со строго
определенными и контролируемыми свойствами, что особенно важно для целей
медицины и высокочувствительных методов анализа (детекции)
' Глава КИНЕТ1/1КО -ЖЧ ТБ=МООИНАМИЧЕСКИЕ
Ш I закономернсх:ти КАТАЛИЗА
"Р ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ I ФЕРМЕНТАМИ
Кинетика действия ферментов в растворе является одним из наиболее хорошо
изученных разделов химической энзимологии. Кинетические закономерности
катализа простыми ферментами подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен,
предложенному еще в начале века. Кооперативные и аллостерические эффекты
в катализе более сложными ферментами (в частности, олигомерными)
описываются на основе модели Моно-Уаймена- Шанже, сформулированной в 60-х
годах. Хорошо разработана теория влияния на кинетику ферментативных
процессов таких факторов, как pH, присутствие ингибиторов и активаторов и
т. п. Несколько более сложными закономерностями характеризуется кинетика
действия ферментов на высокомолекулярные, в том числе, нерастворимые
субстраты (белки, ДНК и РНК, целлюлозу). Однако и в этой области
достигнут-очевидный прогресс.
Закрепление катализатора на носителе создает целый ряд принципиальных
трудностей для описания кинетических закономерностей. Не ^случайно общая
теория гетерогенного катализа до сих пор не создана. В дальнейшем
изложении будет сделана попытка выявить те основные факторы, которые
определяют кинетические закономерности катализа иммобилизованными
ферментами, и выяснить, как изменяются каталитические характеристики
иммобилизованных ферментов по сравнению с нативными ферментами в
растворе.
§ 1. Кинетические параметры ферментативных реакций
В простейшем случае скорость (о) катализируемой ферментом реакции
анализируется в рамках уравнения Михаэлиса- Ментен:
Км.каж + Ио '
97
где [?]о и [S]o - концентрация фермента и субстрата в системе
соответственно; &кат - каталитическая константа ферментативной реакции;
