Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Поэтому исключительную значимость при операциях с белками приобретает
выбор реакции и условий ее проведения: желательно, чтобы эти условия были
мягкими и неденатурирующими. Что же касается получения, трансформации и
химической активации носителей и сшивающих агентов, то здесь практически
нет ограничений в выборе условий реакции. Без особого преувеличения можно
сказать, что любой твердый материал (природный или синтетический) может
быть использован при необходимости в качестве носителя ковалентно
иммобилизованных ферментов (см. гл. 1).
$ 3. Приемы химической (ковалентной) иммобилизации белков
'.реакции образования амидной связи [-С(О)-NH-J. Присоединить белок (Ф) к
носителю (Н) или сшивающему агенту (С) посредством амидной связи можно
многими путями и при участии различных функциональных групп. Наиболее
часто применяется реакция ацилирования аминогрупп фермента. В качестве
ацили-рующих агентов широко используются ангидриды:
о
---СО ЯП-9Л0-С II _
(нГс^О + H2N-@ деапхимимут * (н) С NH (ф) (1)
СООН
и хлорангидриды карбоновых кислот:
О О
Cl + HaN-(ф) РН^°" 1!-NH-(c) (2)
В случае ангидридного метода в непосредственной близости от возникшей
амидной связи в препарате иммобилизованного фермента оказывается
карбоксильная группа, образующаяся в ходе
86
реакции (1). Это обстоятельство следует учитывать как с точки зрения ее
возможного влияния на баланс электростатических взаимодействий в белке и
направления локального смещения pH, так и с точки зрения химической
стабильности иммобилизованного препарата: в кислой среде карбоксильная
группа может катализировать гидролиз амидной связи в конъюгате.
В качестве ацилирующих агентов также могут выступать активированные эфиры
(или другие производные карбоновых кислот с хорошими уходящими группами),
например л-нитрофенило-вые эфиры:
Реакция (3) замечательна тем, что в процессе модификации белка
высвобождается нитрофенолят-ион (р/Са = 7), удобная хромофорная метка для
строгого контроля за ходом реакции спектрофотометрическим методом.
Реакционная способность активированных производных карбоновых кислот
падает по мере уменьшения кислотности уходящей группы (от хлорангидридов
до эфиров).
Перечисление ацилирующих агентов можно было бы продолжить и рассмотреть,
например, реакции с ацилазидами, образующимися из гидразидов карбоновых
кислот при их обработке азотистой кислотой. Однако новыми здесь будут
лишь методы (более сложные) подготовки носителей и сшивающих агентов,
тогда как суть проведения самого процесса иммобилизации и тип образуемой
связи в конъюгате будут аналогичны тем, которые характерны реакциям (1) -
(3).
Принципиально иные реагенты и реакции могут быть заимствованы, например,
из такой хорошо разработанной области органической химии, как пептидный
синтез, центральной задачей которого является образование амидных связей.
В качестве удобных ацилирующих агентов в пептидном синтезе используют
производные О-ацилизомочевины:
Реакция (4) отражает взаимодействие аминогрупп фермента с носителем или
сшивающим агентом, содержащими карбоксильные группы активированные
карбодиимидом, R - N=C=N-R. Ииыми словами, карбодиимид служит
конденсирующим агентом н равным образом осуществляет реакцию образования
амидной связи за счет активированных карбоксильных групп белка и
аминогрупп носителя или сшивающего реагента. Низкомолекулярные
карбодиимиды сами по себе могут рассматриваться как своеобразные
сшивающие агенты. Дело в том, что обработка
(c)JLhQ-
о
•NOj + Н+
О)
I-
-С-NH-R + HjN-(ф) +1н-R'
рН4-5; 4°С
:-NH-R' (4)
87
белков такими карбодиимидами может приводить к образованию
межмолекулярных и внутримолекулярных амидных связей между карбоксильными
и аминогруппами белковых молекул: при этом исходный карбодиимид
превращается в соответствующее производное мочевины и не входит в состав
возникшего белкового конъюгата. В пептидном синтезе главным образом
находит применение дициклогексилкарбодиимид, при трансформации которого
образуется дициклогексилмочевина - труднорастворимое в воде вещество и
поэтому легко отделяемое от водорастворимых целевых продуктов. Это
обстоятельство создаёт определенные неудобства при необходимости
иммобилизации ферментов на твердых носителях. Указанный недостаток
устраняется при использовании растворимых карбодиимидов, имеющих
гидрофильные и (или) заряженные группы в боковых радикалах R и R',
например, 1-циклогексил-З-[2-морфолино-(4)-этил]-карбодиимид - ме-то-п-
толуолсульфонат CH:iCf,U4S03
+
С6Нп-N=C=N-СН2-СНг->0
>
V
СНз
Другой пример конденсирующего агента, достаточно широко употребляемого
для ковалентной иммобилизации ферментов путем образования амидной связи,
также заимствован из пептидного синтеза - это изоксазолиевая соль,
реактив Вудворда:
pH3,8-4,5; 20°С
@Ь-с°°н + L I о + H'N~(r)
С,н,
(н^-С-NH-(ф) + Н-О-С-(5)
СН-CONH-CjHs
Условия проведения реакции (5) с реактивом Вудворда в общем близки к
условиям проведения реакции (4) с карбодиимидами, разница лишь в том, что
