Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
в случае реакции (5) применимы и слабощелочные среды. Добавим также, что
реакция (5) протекает весьма энергично и в ряде случаев при использовании
реактива Вудворда, особенно при его избытке, обнаруживается инактивация
ферментов (например, креатинкиназы и гексокиназы).
\J Реакции образования карбамидных связей (производных мочевины: -(NH,
О)-С(0, S)-NH-). Химия мочевины, ее предшественником и производных
чрезвычайно богата и разно-
88
образна по реакциям. Именно синтезом мочевины из циановокислого аммония,
осуществленным Ф. Велером в 1828 г., было положено начало современной
препаративной органической химии. Приведенный пример вполне здесь
уместен, поскольку аналогичная реакция может быть с успехом использована
для ковалентной иммобилизации ферментов.
Изоцианаты, RNCO, способны эффективно взаимодействовать с различными
функциональными группами белков с образованием производных мочевины,
таких, как диалкилмочевины, уретаны и уреиды. Наиболее
реакционноспособными группами белков по отношению к изоцианатам являются
аминогруппы:
@-№=С=0 + H2N-<ф) (c)-NH-|-NH-(c) (б)
Аналогичным образом могут быть применены изотиоцианаты. При этом,
соответственно, образуются производные тиомочевины.
• Одним из самых распространенных методов активации природных
полисахаридных носителей (или синтетических полиолов) является
бромциановый метод. При обработке бромцианом на таких носителях
формируются исключительно реакционноспособные, цианатные, -О-C^N, и
имидокарбонатные,
<0>=NH , группы. При взаимодействии белка с таким образом активированным
носителем образуются изомочевины (7) и уретаны (8):
(ЙХ^с=кн + h2n--(r) -НГС ^
NH
(Н^-0-С-NH-(r) (7)
'ОН
О
(hV-O-I-NH-@ ^ОН
(8)
Полиольные носители (в том числе полисахариды) активируют также
алкилхлорформиатами, при этом получают циклические карбонаты, эффективно
взаимодействующие с аминогруппами белков:
При обработке нитрилов, например полиакрилнитрила, хлорводо-родом и
спиртами в безводной среде получают хлоргидраты ими-доэфиров:
89
Имидоэфиры могут быть также синтезированы при алкилировании
(диметилсульфатом) амидной группы, например, в полиамидах. В свою очередь
они легко реагируют с аминогруппами белков с образованием амидинов:
t)JH,cr . Ji н
(н)-С. + H,N (ф) С" (Н>-C^-NH-(r) (Ю)
OR акт пси
"сов
В случае реакции с имидоэфирами (10) образующаяся в конъюгате связь
химически более прочная, чем в (7) - (9). Дело в том, что характерная
особенность конъюгатов, получаемых по реакциям (7) -(9), заключается в
возникновении соединительной группировки уретанового типа, т. е.
содержащей сложноэфирную связь. Эта связь может расщепляться под
действием нуклеофильных реагентов, в том числе под действием аминогрупп
белков:
Эта реакция может быть положена в основу получения сшитых димеров белков
или их субъединиц (одинаковых или разных) либо ею можно воспользоваться
для удаления иммобилизованного фермента с носителя. В том же случае,
когда отщепление иммобилизованного белка от носителя крайне нежелательно,
следует исходить из других типов носителей, например носителей,
содержащих вместо гидроксильных групп аминогруппы.
^[Реакции образования вторичных аминов (связи -NH-). Первичные а- и е-
аминогруппы белков могут быть трансформированы во вторичные в реакциях
алкилирования и арилирования, а также путем восстановления азометиновых
связей (оснований Шиффа). Если в качестве алкилирующих или арилирующих
агентов использовать соответствующие носители и сшивающие агенты, то
образуются конъюгаты, в которых белковая часть фермента закреплена
прочной, негидролизуемой азот-углеродной связью, причем вторичный амин
легко протонируется и, таким образом, может нести на себе положительный
заряд так же, как исходная аминогруппа.
Хорошо известными алкилирующими и арилирующими агентами служат
галогенпроизводные алифатических и ароматических углеводородов, а также
метилкетонов. Взаимодействие носителей и сшивающих агентов, содержащих
активный атом галогена при атоме углерода, с ферментами протекает по
схеме (12)
СН,-Cl + H,N-(ф) --- сн,-NH-(ф) + НС1 (12)
90
в щелочной среде, требующейся для депротоннрования аминогруппы и
связывания образующегося хлорида водорода. В этих условиях алкилируются
также тиольные группы цистеина, имида-зольные - гистидина, гидроксильные
- тирозина и, в меньшей степени, алифатические гидроксильные группы
белка. В качестве арилирующих агентов, помимо галогенпроизводных, могут
быть применены и сульфопроизводные. Однако в последнем случае наряду с
реакцией алкилирования может протекать и реакция сульфирования аминогрупп
белка с образованием сульфамидной связи.
В общем число алкилирующих и ацилирующих агентов очень большое. Но
особого упоминания заслуживает метод, использующий хлорпроизводные 1,3,5-
триазина, в частности цианурхло-рид, из-за его простоты и надежности. В
цианурхлориде три атома хлора связаны с атомами углерода. В присутствии
соединений с HS-, H2N- и НО-группами происходит быстрое расщепление одной
