Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
практически все из нескольких десятков ферментов различных классов,
изученных в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда
74
даже приобретают более высокую каталитическую активность по сравнению с
водным раствором.
После завершения ферментативной реакции в микроэмульсии фермент можно
регенерировать для повторного использования, например, путем добавления в
систему избытка ацетона. Фермент при этом выпадает в осадок в виде так
называемого ацетонового порошка, сохраняя каталитическую активность,
тогда как основная доля ПАВ вместе с продуктом реакции остается в
растворе. Последнее обстоятельство является одним из основных недостатков
микроэмульсий как среды для проведения ферментативных реакций, поскольку
отделение продукта от примеси ПАВ нередко представляет собой весьма
трудную задачу.
Затруднений такого рода можно избежать, если использовать так называемые
бездетергентные микроэмульсии, для образования которых вообще не
требуется введения ПАВ. Бездетергентные микроэмульсии образуются в
тройных системах типа гек-сан - изопропиловый спирт - вода или толуол -
изопропиловый спирт - вода. При определенном соотношении компонентов вода
в таких системах существует в виде сферических капель размером от 5 до 30
нм, стабилизированных адсорбированными на их поверхности молекулами
изопропилового спирта. При растворении в бездетергентной микроэмульсии
молекулы фермента оказываются включенными в водные микрокапли, как это
показано на рис. 10, г, причем их каталитическая активность сохраняется.
Для отделения фермента от реакционной смеси после завершения реакции
можно просто изменить состав системы путем добавления одного из
компонентов, в результате чего произойдет ее расслоение на водную и
органическую фазы, содержащие, соответственно, фермент и продукт реакция.
Важнейшим преимуществом системы двухфазного типа на основе воды и
неполярного органического растворителя является то, что они дают
возможность легко осуществлять ферментативные превращения соединений,
нерастворимых в воде, но растворяющихся в органической фазе. Кроме того,
благодаря низкому содержанию воды в таких системах удается проводить
реакции, равновесие которых в водном растворе по термодинамическим
причинам почти полностью сдвинуто в сторону исходных веществ. Речь идет
прежде всего о реакциях, протекающих с образованием воды в качестве
одного из продуктов, таких, как синтез пептидов, сложных эфиров и т. п.
$18. Двухфазные водные системы
В основе этого способа иммобилизации, предложенного Б. Ма-тиассоном
(1982), лежит тот факт, что водные растворы некоторых полимеров
(полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта и других) обладают
свойством не смешиваться между собой или с концентрированным водным
раствором электролита, образуя системы двухфазного типа. Обычно
используемые кон-
75
центрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5 до 15%.
Наибольшее распространение получили системы, состоящие из несмешивающихся
между собой водных растворов полиэтиленгликоля и декстрана, один из
которых диспергирован в другом в виде мелких капель. Варьируя природу
входящих в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно
подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции находятся
преимущественно в разных фазах, что позволяет отделять продукты реакции
от биокатализатора. Примером использования этого подхода может служить
гидролиз крахмала под действием смеси а-амилазы и амилоглюкозидазы в
двухфазной системе, состоящей из несмешивающихся друг с другом водных
растворов крахмала и полиэтиленгликоля.
Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно отнести почти
полное отсутствие диффузионных ограничений при протекании реакции,
простоту приготовления и доступность необходимых компонентов, двухфазные
водные системы имеют однако, серьезные недостатки. Главный из них - это
то, что вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и
небольшая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты реакции. Это
приводит к загрязнению продуктов и потерям дорогостоящего катализатора.
Чтобы избежать этого нежелательного явления, приходится применять
дополнительные устройства, например мембранные ультрафильтры, что
приводит к замедлению и удорожанию всего процесса.
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является
то, что^путем химического воздействия на структуру фермента в его
молекуле создаются новые кова-д&нтные-еея^ц-в частности между белком и
носителем,______
Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических
методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-
первых/ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую
прочность образующегося конъюгата. Иными словами,
ТТрТГ'достатЬ'Гйо'ТШГроком варьировании условий, таких, как pH и
температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых
