Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
из трех С-Cl-связей, затем (более медленно) подвергается расщеплению и
вторая группа, а третья обычно в реакции арили-рования участия не
принимает (время иммобилизации около суток при 4°С). Цианурхлорид может
быть с успехом применен для активации носителей, например полисахаридов,
а также как бифункциональный сшивающий или вшиваемый агент.
Исключительно эффективными алкилнрующнми агентами являются такие
производные олефинов, как имины, оксиды и тио-оксиды (оксираны и
тиираны):
СН-СН, + H,N-<ф) ------ (н)-СН-СН,-NH-(ф) (13)
(НО- HS-) I (-0-.-S-)
где X -- >NH,>0,>S
Реакцию (13) можно проводить в средах с различными значениями pH, причем
от выбора pH существенно зависит направление реакции: по амино- или
оксигруппам белка.
Реакции как алкилирования, так и арилирования можно провести путем
присоединения фермента (посредством его тнольных, амино- и гидроксильных
групп) по активированным двойным связям. Для этой цели используют
гидроксилсодержащие носители, предварительно активированные
дивинилсульфоном или бензохиноном. Процесс иммобилизации можно
представить, соответственно, схемами (14) и (15):
(c)-О-СН,-СН,-SO,-СН=СН, + H,N-(c) -РН>8-""
(HS-, но-)
-*- (S>-°(сн*ь~8°, (ей,),-НН-(r) (14)
(-0-.-S-)
91
о
о
II
II
(r)ьк>пГ)
(15)
II
II
О
О
Реакции активации носителей бензохиноном и последующего присоединения к
таким носителям фермента правильнее было бы называть окислительным
арилированием, поскольку в качестве промежуточных группировок в них
образуются' гидрохиноновые, которые, в свою очередь, окисляются хиноном
или растворенным кислородом воздуха (среда щелочная, что благоприятствует
процессу окисления).
Если теперь вернуться к рассмотренным реакциям (1) - (15), то можно
констатировать, что все эти реакции в общем-то неспецифические и помимо
аминогрупп в них могут принимать участие, как это уже отмечалось, другие
функциональные группы: тиоль-ные, имидазольные, гидроксильные. Одним из
наиболее распространенных методов специфической модификации аминогрупп
белков является образование азометиновых связей, -CH=N-, в реакциях
белков с альдегидами (16):
Продукты конденсации амино- и альдегидсодержащих соединений - основания
Шиффа - образуются легко и быстро в щелочных средах и в этих условиях
весьма стабильны. Особенно широкое распространение в методах
иммобилизации получили диальдегиды, такие, как глутаровый альдегид,
используемый в качестве сшивающего агента. При применении
низкомолекулярных альдегидов, в том числе глутарового, необходимо
учитывать возможность образования разнообразных побочных продуктов
полимеризации и поликонденсации уже в исходных реагентах. В результате
при действии глутарового альдегида на фермент помимо оснований Шиффа
могут возникать и другие конъюгаты, в том числе связанные через вторичное
амины.
Характерной особенностью азометиновой связи является то, что она легко
разрушается в кислых средах с регенерацией исходных веществ реакции (16).
Это ее свойство может использоваться для удаления с носителя ковалентно
иммобилизованного фермента путем простого изменения pH среды. Очевидно
также, что азоме-тиновая связь непригодна для ковалентной иммобилизации
ферментов, предназначенных для работы в кислых средах. Однако
устойчивости конъюгатов с азометиновой связью к кислотам можно добиться
путем восстановления этой группировки:
@-<*н 2N-(c)
pH >8
(C?j)-CH=N-(ф)
(16)
pH <6
CH=N-(Ф)
pH >8
NaBH*
^H)-СН,-NH-(ф)
(17)
92
Реакция (17) приводит к образованию вторичного амина, прочной ковалентной
связующей группировки между белком и носителем или сшивающим агентом.
Взаимодействие альдегидных и аминогрупп можно осуществить и таким
образом, чтобы сразу (в один прием) получить прочный конъюгат. Примером
такого процесса служит метод Уги, который схематически может быть
представлен реакцией (18):
R.-СГ + R2_NH2 + R3-of -\- R4-NC->-
хОН ХН
Ri-С (О)-N (R2)-СН (R3)-С (О)- NH-R< (18)
Как видно из схемы, помимо альдегидных и аминных групп в реакцию (18)
вступают соединения с карбоксильной группой и изонитрилы с образованием
амидной связи между белком и носителем. Иными словами, по методу Уги
ферменты можно ковалентно иммобилизовать на носителях, содержащих
альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и
карбоксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть
осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группировки в
присутствии низкомолекулярных альдегидов.
\ш*еакции азосочетания (образование азосоединеиий со связью - nl=N-).
Соли диазония [Аг-N=N] + C1- способны вступать в различные реакции
сочетания, скорость которых и направление существенно зависят от рн среды
и природы ароматического субстрата. В реакциях азосочетания могут, в
принципе, участвовать аминные, гуанидиновые, тиольные, имидазольные и
фенольные группы белков, причем в ряде случаев с одной функциональной
группой могут реагировать две диазогруппы.
В слабощелочной среде основной группой-мишенью в белке является фенольный
