Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
ковалентном вшивании молекулы фермента в различные типы сеток (рис. 11,
в). Идея конструирования ферментных сеток (ретикуляция ферментов)
вытекает из полифункииональной природы самой молекулы фермента, имеющей
на поверхности по-
79
мимо активного центра достаточно большое количество реакционноспособных
групп. При введении в раствор фермента бифункционального сшивающего
агента отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют
более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами
служат сами молекулы фермента. В зависимости от природы и количества
сшивающего агента можно получить как водорастворимые, так и
водонерастворимые препараты.
Другой прием ретикуляции основан на использовании ферментов,
предварительно ковалентно модифицированных реагентом, содержащим двойную
связь, например акрилоилхлоридом. В этом случае при сополимеризации
белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с
акриламидом) образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или
дополнительным сшивающим мономером (например, N, N-мети-лен-бис-
акриламидом). В рассматриваемой системе исходное состояние - жидкий
раствор, а конечное (после полимеризации) - твердое тело (гель), причем,
естественно, оно приобретает форму того сосуда (реактора), в котором
проводится полимеризация. Целенаправленное использование этого явления
положено в основу целого ряда оригинальных способов иммобилизации.
Сшивкой белка в объеме растворителя (сополи-меризацией) получают
трехмерный гель (рис. 12, а) в виде крупного однородного блока, который
можно механически измельчать и использовать в виде более или менее мелких
частиц в суспензиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредственно в
виде мелких частиц сферической формы путем эмульсионной полимеризации.
Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего
мономеры, в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Предельный
вариант таких систем - микроэмульсии, или гидратированные обращенные
мицеллы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях.
В мицеллярных системах размеры "капелек", содержащих модифицированный
фермент и мономеры, можно варьировать и даже получать их близкими к
собственным размерам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации
- молекулярный уровень. Иными словами, при использовании систем
обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях, можно обшивать
отдельные молекулы фермента полимерной оболочкой заданной толщины, т. е.
в полном смысле одеть фермент в "рубашку, сшитую по мерке" (рис. 12,6).
Процесс ретикудяции может быть реализован не только в растворе фермента,
но и при использовании его иммобилизованных препаратов. Так, в случае
фермента, предварительно иммобилизованного на химически инертном носителе
путем физической адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом
приведет к повышению прочности (задубливанию) препарата. Носитель здесь
непосредственно не принимает участия в химической реакции - он служит
лишь матрицей для организации
80
сополимеризация в однородном растворе
сополимеризация в м икроэмульсионной системе
6
химическое задубливание слоя адсорбированного фермента
введение в' молекулу фермента "химических скобок11
г
Рис. 12. Типы ретикуляции ферментов: а межмолекулярная трехмерная сетка;
6 - сетчатая оболочка вокруг молекулы фермента (молекулярно
иммобилизованный фермент); в - межмолекулярная двумерная сетка; г -
внутримолекулярная сетка из полипептидных цепей белка и химических
"скобок"
слоя (монослоя) адсорбированного фермента и обусловливает двумерную
направленность ретикуляции. Более того, носитель может быть вообще удален
(например, нитроцеллюлозу растворяют в метаноле) и, таким образом,
получится сшитая ферментная пленка (рис. 12,в).
В принципе можно представить себе "нульмерную" ретикуля-
81
цию, поскольку являющаяся узлом ферментной сетки молекула фермента - это
не условная точка, а довольно-таки крупный объект. Иными словами, от
сеток межмолекулярых перейдем к внутримолекулярным, составленным из
полимерных цепей белка и химических сшивок. Один из примеров такого рода
был уже рассмотрен (рис. 12,6). Добавим, что препараты молеку-лярно
иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы
бифункионального сшивающего реагента провзаимо-действуют с одной и той же
молекулой белка. В таком случае (рис. 12, г) речь идет о наложении
"химических скобок", внутри-молекулярно закрепляющих структуру фермента.
Практическая реализация этого подхода в гомогенном растворе затруднена
из-за образования наряду с внутримолекулярными межмолеку-лярных сшивок.
Исключить межмолекулярные взаимодействия можно путем перехода от
гомогенных к микрогетерогениым системам с пространственно изолированными
молекулами фермента, например солюбилизацией ферментов в органических
растворителях с помощью гидратированных обращенных мицелл ПАВ.
$ 2. Химическая структура ферментов и их функциональные группы
