Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Кгл.каж - определяемое эффективное (кажущееся) значение константы
Михаэлиса.
Параметр Км.юж служит характеристикой сродства фермента к субстрату и,
следовательно, является мерой той концентрации субстрата, которая
необходима для насыщения фермента. При катализе иммобилизованными
ферментами концентрация субстрата вблизи фермента (локальная) может
отличаться от концентрации субстрата во всем объеме системы. В этом
случае наблюдаемая на опыте /См.каж должна зависеть от распределения
субстрата между свободным раствором и носителем, где сосредоточен
фермент. Что касается параметра kKar, то он характеризует реакционную
способность уже образовавшегося фермент-субстратного комплекса, поэтому
не зависит от распределения субстрата в системе, а определяется
состоянием, в первую очередь, конформацией самого фермента.
Каталитические параметры ферментативной реакции (ftKaT и /См.каж) могут
зависеть от наличия в реакционной системе различных эффекторов, таких,
как ингибиторы и активаторы, ионы водорода и т. п. В таких случаях
необходимо учитывать распределение также этих эффекторов между раствором
и ферментсодержащей матрицей.
Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при катализе
иммобилизованными ферментами, можно разделить на две группы. К первой из
них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилизации на состояние
(конформацию) фермента, а ко второй - эффекты, обусловленные
распределением реагентов в системе.
§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента
Конформационные свойства иммобилизованных ферментов.
При иммобилизации существует опасность, что белок присоединится к
носителю в конформации, отличной от нативной. В этом случае
каталитическая активность фермента может существенно измениться или
вообще исчезнуть.
Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные изменения при
иммобилизации, решается исследованием структуры иммобилизованных
ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали
оптические методы (спектрофотометрический, флуоресцентный), метод
спиновых меток и др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать
следующие выводы.
1. В результате иммобилизации пространственная структура фермента может
либо существенно измениться, либо измениться незначительно, либо остаться
неизменной (что наблюдается чаще всего).
2. В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-
98
ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех причин. Во-
первых, конформационные различия могут быть обусловлены химической
модификацией каких-либо важных д-.я структуры функциональных групп белка
и не связаны с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. его
присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора,
необходимо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затрагивающий
этих функциональных групп в белке. Кроме того, часто фермент удается
защитить от инактивации на стадии иммобилизации простым добавлением
субстрата или другого специфического лиганда в насыщающей концентрации,
что позволяет получать препараты с более высокой удельной каталитической
активностью (т. е. активностью, отнесенной к 1 г носителя).
Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут быть
неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные,
водородные связи) между ферментом и носителем; приводящие к денатурации.
Чтобы избежать этих взаимодействий, иногда достаточно заменить носитель
на инертный по отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают
полисахаридные носители, полиакриламид и некоторые другие. Если замена
носителя по какой-либо причине нежелательна, то используют следующий
методический прием: отдаляют белковые молекулы от поверхности носителя за
счет увеличения длины "ножки" (сшивающего агента). При этом, как правило,
удается ослабить неблагоприятное для фермента воздействие носителя.
И наконец, третьей возможной причиной различия структур нативного и
иммобилизованного ферментов может быть большое число связей между
ферментом и носителем.
3. В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в результате
иммобилизации конформация фермента практически не изменяется, но
нарушается динамика конформационных изменений в белке. Так, у белков,
связанных с носителями, могут замедляться необходимые для катализа
конформационные переходы, уменьшаться число конформационных стадий и
глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифические
взаимодействия функциональных групп белка с носителем. Чтобы избежать их,
необходимо, как показывает практика, проводить иммобилизацию на инертных
носителях.
Фиксация "напряженных" состояний фермента. Иногда исследователи
целенаправленно стремятся "закрепить" с помощью иммобилизации конформацию
фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным
для детекции конформационных изменений в ферментах, индуцированных
субстратами, кофакторами и другими специфическими лигандами.
