Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
радикал тирозина (атаке ионом диазония в этих условиях может также
подвергаться незащищенный незаряженный имидазол гистидина):
||Q
(нь0кй^ ¦ ho-Qms)-^^- (,9)
В результате реакции (19) быстро образуется прочный конъюгат белка с
носителем, связанный через диазогруппу. Важно отметить простоту процедуры
иммобилизации этим методом, несложным также является получение соли
диазония при работе с носителем (или сшивающим агентом), содержащим n-
аминофенильные функциональные группы. Добавим, что комбинацией различных
химических приемов можно вводить аминофенильные группы в разнообразные
носители, например в полистирол и даже в полиакриламид.
Ч/Реакции тиол-дисульфидного обмена (образование дисуль-фидной связи, -s
-S-). В предыдущем разделе было отмечено, что свободные сульфгидрильные
группы в белках встречаются
93
доволно-таки редко из-за ярко выраженной способности к окислению и
образованию в нативных условиях дисульфидных мостиков - сшивок, которые,
однако, в белках нетрудно восстановить до исходных сульфгидрильных групп.
Способность к созданию дисульфидных мостиков может быть использована для
ковалентной иммобилизации ферментов путем формирования межмолеку-лярных
дисульфидных связей по реакции (20):
Окисление сульфгидрильных групп до дисульфидных протекает спонтанно под
действием растворенного кислорода воздуха. С целью увеличения содержания
тиольных групп в исходном белке проводят восстановление дисульфидных
связей подходящим восстановителем, например боргидридом натрия,
меркаптоэтанолом, дитиотреитолом, цистеином или его производными. Однако
реокис-' ление тиольных групп при проведении реакции (20) может приводить
к образованию "неправильных" внутримолекулярных дисульфидных мостиков в
белке и, таким образом, сопровождаться существенной потерей
каталитической активности иммобилизованного фермента. Содержание
сульфгидрильных групп в белке можно увеличить за счет введения эндогенных
групп, т. е. тиоли-рованием. Для этого, избрав в качестве групп-мишеней
аминогруппы белка, обрабатывают их подходящими ацилирующими или
алкилирующими реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу,
например тиолактоном гомоцистеина. Пример указанного реагента интересен
тем, что при его использовании в белке увеличивается содержание
сульфгидрильных групп, тогда как число аминогрупп не изменяется (а- и е-
амино-группы белка образуют с реагентом амидную связь, однако реагент
несет на себе собственную а-аминогруппу, а также сульфгидрильную,
формируемую при раскрытии лактонного кольца).
В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилизации ферментов путем
образования дисульфидных мостиков является использование реакций тиол-
дисульфидного обмена (при этом резко уменьшается вероятность закрепления
"неправильных" дисульфидных внутримолекулярных мостиков в белке). Суть
этого процесса можно выразить реакцией (21):
Ri-S-S-R2 + HS-R3=i=iRi- S-S-R3 + HS -R2 (21)
где Ri, R2 и R3 могут представлять собой белок, носитель, сшивающий агент
и (или) радикал низкомолекулярного тиола. Реакции тиол-дисульфидного
обмена обычно происходят в сильнокислой среде, но могут катализироваться
тиольными анионами в нейтральных и щелочных растворах. Примером
иммобилизации ферментов по реакции (21) может служить взаимодействие
белка с носителем, содержащим дитионитробеизойную группу:
[О]
(20)
94
уСОО-
(н)-S-S -^^>-СОО- + HS-(r) t'H* * (r)-S-S-(5) + V-NOj + H+ (22)
NOj
В этом методе присоединение фермента к носителю удобно контролировать
спектрофотометрически (Х = 412нм, е= 13 600) по количеству
освобождающегося тионитробензоата.
Важным достоинством методов иммобилизации, основанных на реакции тиол-
дисульфидиого обмена, является простота процедуры как присоединения
фермента к носителю, так и отщепления (под действием низкомолекулярного
тиола).
Радикальные реакции (графт-сополимеризация). Одним из распространенных
приемов получения синтетических полимерных материалов служит графт-
сополимеризация, осуществляемая, иапример, путем химической прививки
одного полимера к другому. Эта цель достигается при рекомбинации
макрорадикалбв, образующихся в исходной смеси полимеров при воздействии
мощного источника у-излучения. Нетрудно представить себе аналогичную
ситуацию, когда в роли одного из компонентов смеси выступает биополимер,
фермент. Однако жесткое облучение ферментов сопровождается, как правило,
их необратимой инактивацией. Потери ферментативной активности могут быть
существенно снижены при переходе к фотоинициируемым реакциям. Примером
фотореактивных агентов являются алкил- и арила-зиды, которые, в свою
очередь, могут входить в состав носителей или сшивающих агентов. При
фотохимическом распаде таких соединений образуются молекулы азота и
короткоживу-щие (0,1 -10 мс) высокореакционноспособные радикалы - нит-
рены:
R-N3 R-N + Н2
••
взаимодействующие практически с любыми группами белка с образованием
прочных ковалентных связей.
