Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации
процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения
устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-
вторых, Ухимическая модификация ферментов способна приводить
^существенным изменениям их свойств, таких, как субстратная
специфичность, каталитическая активность и стабильность. Именно
химическими методами, путем многоточечного'ковалентно го закрепления
белковой структуры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации
ферментов.
§ 1. Основные принципы конструирования препаратов ковалентно
иммобилизованных ферментов
Для целей иммобилизации существует буквально неограниченный набор
различных материалов: неорганических (стекла, керамика, оксиды металлов и
т.д.), природных полимеров (целлюлоза, хитин, агароза, крахмал и другие
полисахариды) и, конечно, синтетических полимеров и сополимеров (см. гл.
1). Одни из этих веществ могут быть использованы непосредственно в
качестве носителей, другие предварительно должны быть под-
Гпава
з
77
вергнуты специальной химической обработке активаторами или
модифицирующими агентами. Иными словами, "химическая методология"
иммобилизации не испытывает недостатка ни в выборе исходных материалов,
ни в способах их трансформации. Однако все это составляет предмет и
задачи тактики. Что же касается стратегической линии, то она базируется
на принципах конструкции конечного препарата, а таких принципов всего
три.
Дело в том, что независимо от числа и химической природы компонентов,
вовлеченных в процесс иммобилизации, числа и сложности отдельных стадий
этого процесса, принципиально различающихся элементов-блоков химических
конструкций не более трех: собственно молекула фермента (Ф), носитель (Н)
и сшивающий би- или полифункциональный реагент (С), называемый также
"сшивка", "вставка", "ножка", "спейсер" и т. п.
¦ Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов подразумевает
создание конструкций из связанных химическими связями трех элементов: Н -
С - Ф (как максимум) и (или) двух, Н - Ф и С - Ф (как минимум). В свою
очередь принципы конструирования соответствующих конъюгатов можно
наглядно обозначить терминами "пришивка" (для Н - Ф), "сшивка" (для Н - С
- Ф) и "вшивка" (для С - Ф).
Рассмотрим эти принципы более подробно. При наличии на поверхности
носителя функциональных групп, способных вступать в химические реакции с
функциональными группами фермента с образованием ковалентных связей:
получение иммобилизованного фермента сводится к исключительно простой
процедуре, аналогичной используемой для физической адсорбции фермента на
носителе. Методических различий здесь действительно нет: в раствор
фермента вводится носитель и фермент на нем адсорбируется, однако
адсорбция при химической иммобилизации необратимая - фермент пришивается
к носителю одной или несколькими ковалентными связями (рис. 11, о).
Тесный контакт белка с носителем может оказаться нежелательным, например,
из-за неблагоприятного изменения микросреды фермента, стерических и
диффузионных ограничений. Выходом из такой ситуации становится отдаление
молекулы иммобилизованного фермента от поверхности носителя на некоторое
расстояние. Для этой цели применяются сшивающие реагенты различной длины.
Они могут быть как простыми бифункциональными (т. е. с двумя одинаковыми
или различными по химической природе реакционноспособными группировками),
так и весьма сложными полифункциональными реагентами, в том числе
построенными из отличающихся по химической природе звеньев с различными
по прочности связями между ними. Тем не менее зде'сь используется один
общий принцип ковалентной иммобилизации - сшивка фермента с носителем
посредством сшивающего агента (рис. 11,6).
По разнообразию методических приемов, по крайней мере
78
| * Д -|~<3
(H) (Ф)
a
|*+*-+Д- I* •<!
(H) (С) <"M /
6
-• + ?)-
(С) (Ф) ''
в
Рис. 11. Блок-схемы ковалентной иммобилизации ферментов
за счет сшивающегося агента, этот способ несравнимо богаче и гибче
предыдущего. Во-первых, подбором длины сшивающего агента (или подбором
оптимальной смеси сшивающих агентов различной длины) можно изменять
каталитические характеристики иммобилизованного фермента. Во-вторых,
можно специально конструировать сшивку так, чтобы она содержала связь,
лабильную в определенных условиях или специфически расщепляемую
определенными реагентами (в частности, ферментативно). Это дает ключ к
контролируемому отделению иммобилизованного фермента от носителя,
например, при решении проблем направленного транспорта ферментов в живом
организме.
Целый ряд разнообразных решений задачи ковалентной иммобилизации
ферментов дает использование систем, изначально не содержащих носителя, а
только фермент и сшивающие агенты, где носитель (как твердое тело)
формируется непосредственно в процессе иммобилизации или же сам фермент
служит одновременно и носителем. Речь, таким образом, пойдет здесь о
