Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Основным недостатком мембранных систем, как и систем на основе полимерных
гелей, является невозможность ферментативного превращения
высокомолекулярных субстратов, для которых мембрана создает непреодолимый
диффузионный барьер.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ДВУХФАЗНОГО ТИПА
Отличительная черта этого способа иммобилизации состоит в том, что
ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается не
за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или
мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из
фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной
реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их
растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что
продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После
завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу,
содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла
процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является
то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения
макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких
носителей с ограниченным размером пор.
72
§ 16. Двухфазные системы типа
"вода - несмешивающийся с водой органический растворитель"
В таких системах фермент присутствует только в водной фазе, поскольку
белки, как правило, нерастворимы в неполярных органических растворителях,
выступающих в роли второй фазы. Субстрат, введенный в двухфазную систему,
перерабатывается под действием фермента в водной фазе, а образующийся про
дукт экстрагируется в фазу органического растворителя (рис. 10, а). Объем
водной фазы составляет обычно 1-2% от общего объема системы. В ходе
процесса реакционную смесь осторожно перемешивают, чтобы ускорить
диффузию субстрата и продукта через границу раздела фаз.
Основные недостатки этого способа иммобилизации - низкая скорость
процесса вследствие небольшой площади поверхности раздела фаз, через
которую осуществляется перенос субстрата и продукта, и возможность
инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Именно
последнее обстоятельство не позволяет применять интенсивное перемешивание
системы для увеличения скорости процесса за счет возрастания noBepxHocfH
раздела, поскольку в образующейся эмульсии фермент быстро теряет
активность. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения
поверхности раздела, в качестве ферментсодержащей фазы часто применяется
крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло),
частицы которого пропитаны водным раствором фермента (рис. 10, б) .
§17. Микроэмульсии
Проблема увеличения поверхности раздела фаз может быть решена при
использовании в качестве среды для ферментативных реакций уже
упоминавшихся выше микроэмульсий типа "вода в масле" (см. рис. 8, в),
введенных в арсенал энзимологии К. Мартинеком с сотр. (1977). Методика
получения ферментсодержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в
виде водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов от
общего объема системы) или лиофилизованного порошка вносят в раствор ПАВ
в неполярном органическом растворителе и энергично перемешивают в течение
нескольких минут (при введении фермента в сухом виде для обеспечения его
солюбилизации в систему необходимо заранее добавить нужное количество
водного буферного раствора). В результате образуется полностью прозрачный
гомогенный раствор, в котором молекулы фермента включены внутрь
гидратированных обращенных мицелл ПАВ, или микроэмульсионных капель,
причем в каждой белоксодержащей мицелле присутствует обычно только одна
молекула фермента (рис. 10, в). Диаметр сферических капель в зависимости
от ряда факторов (природа органического растворителя и ПАВ, количество
добавленной воды и т. п.) колеблется от нескольких единиц до 20 нм.
73
изопропиловый
Рис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного
типа: а - двухфазная система типа "вода - несмешивающийся с во дой
органический растворитель", б - частица крупнопористого неорганического
носителя, пропитанная водным раствором фермента, в органическом
растворителе; в - фермент, включенный в гидратированную обращенную
мицеллу ПАВ в органическом растворителе, г - фермент, включенный в водную
микрокаплю бездетергентной микроэмульсии
Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией
субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют из-за
огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и
органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем
состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли,
защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем
молекул ПАВ, как это показано на рис. 10, в. Микроэмульсии представляют
собой универсальную микрогетеро-генную среду для ферментативных реакций:
