Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Основой любого фермента является белок, представляющий собой компактную
конструкцию из одной или нескольких поли-пептидных цепей, ковалентно
связанных (сшитых) дисульфид-ными мостиками. Помимо белка ферменты иногда
могут содержать и небелковые компоненты: простетические группы
неорганической и органической природы, липиды (в липопротеидах) и
углеводы (в гликопротеидах). Конечно, в общем случае химические методы
иммобилизации нацелены на модификацию функциональных групп в белковой
части молекулы фермента. Однако при выборе процедуры иммобилизации для
конкретного фермента целесообразно учитывать и специфические особенности
строения его молекулы. В этой связи укажем на хорошо известный и яркий
пример ковалентной иммобилизации гликопротеидов. Относительно простым
методом - окислением перйодатом натрия в мягких условиях - в
полисахаридную часть фермента вводятся альдегидные группы, посредством
которых на следующем этапе и осуществляется химическое взаимодействие с
носителями или сшивающими агентами, содержащими аминогруппы (образованием
азометиновых связей, оснований Шиффа).
Белковые части ферментов построены (рис. 13) из ~20 аминокислот,
соединенных между собой пептидной связью. Количество аминокислотных
остатков в полипептидных цепях белков составляет от нескольких десятков
до тысяч. Однако качественный состав белков (содержание тех или иных
аминокислотных остатков) оказывается весьма сходным. Почти половину всех
аминокислотных остатков белка составляют аминокислоты с неполярными или
слабополярными боковыми группами. В резуль-
82
(3-5)
Ершпофен
(1-2)
,(1-3)
d-3)
(2-6)
(5-8)
(1-4)
-Р
НС-(С!
С-(СН,) ,-NH-С-NH,
1 I
NH NH
С-О
нА-
:-сн,-
Ан
с=о
н|-(СН,),-S-сн, NH
Ч- м
с=° pH -NH
NH
Н-
с=о
не-сн,-(' ')-он
NH
IP"
н|-СН,-"-NH
-О
N
ч-
НС-(СНз) 4-NH, NH
Г
НС-СН,-SH NH,
глутаминовая кислота (8 - 12)
аспарагиновая кислота (8 - J2)
серии
(6-7)
треонин
(5-7)
глутамин
валяя, лейцин, ¦эол сшита, фенилаланин ¦ пр.
(40 - 50)
NH
I
Н^-(СН,) ,-с ООН
ii
НС-СИ,-СООН
А-=о
NH
нА-СН,-ОН
и
~т
НС-СН(СН,)-он
1=0
-|-
NH
I
НС-(СН,),-C(0)NH,
с=о
Ч-
NH
I
НС-СН,-C(0)NH,
А-о
NH
I
НС-R
Аоон
катаеыя
амино-
группа
концевая
карбокевдаш
группа
Рис. 13. Полипептидная цепь. Условно составлена из аминокислот в порядке
убывания числа химических реакций, в которых способны принимать участие
функциональные группы их боковых радикалов; в скобках при названиях
аминокислот указано среднее процентное содержание в белках
тате этого за счет гидрофобных взаимодействий полипептидные цепи
сворачиваются в глобулярные структуры, ядро которых и составляют
неполярные фрагменты полипентидных цепей, а наружный слой образуют звенья
с полярными и ионогенными группами, такими, как -SH, -ОН, -СООН, -ЫНг.
Конечно, некоторое количество гидрофобных группировок также может
оказываться на поверхности; из них на глобуле формируются контактные
участки для связывания субстратов и (или) для межсубъединичных
взаимодействий. Ароматические аминокислотные остатки (тирозина- и
триптофана) распределены между внутренними областями и наружным слоем
так, что лишь часть из них оказывается доступной растворителю и,
следовательно, растворенным в нем химическим реагентам.
83
Таким образом, с точки зрения возможностей ковалентной иммобилизации
ферментов белковые молекулы удобно представить в виде своеобразных
шариков с экспонированными наружу функциональными группами: тиольными
(цистеина), гидроксильными (алифатическими - серина и треонина,
ароматическими - тирозина), карбоксильными (глутаминовой и аспарагиновой
кислот, а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имида-зольными
(гистидина) и аминогруппами (е-лизина и а-, N-кои-цевыми). Оценку
количества тех или иных групп в различных белках в первом приближении
можно сделать по данным, приведенным на рис. 13. Например, в таком
небольшом белке, как трипсин или химотрипсин, с молекулярной массой около
25 ООО, должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических ОН-
групп, 3-7 остатков тирозина, 7-12 остатков аргинина, свыше 10 аминогрупп
и 40 карбоксильных групп. Результаты такой оценки соответствуют известным
экспериментальным данным.
Но, конечно, нет правил без исключений. В природе встречаются белки,
вообще не содержащие некоторых из приведенных на рис. 13 аминокислотных
остатков, например цистеина. В пепсине, протеолитическом ферменте с
молекулярной массой около 35 ООО имеются не два десятка, как этого можно
было бы ожидать, а всего лишь две аминогруппы: одна в-лизина и одна УУ-
концевая. Но недостаток одних групп на поверхности белковой молекулы
компенсируется другими. В общем, количество функциональных групп в
белках, доступных модифицирующим агентам, достаточно велико и, казалось
бы, нет особых проблем для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с
использованием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы
существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной
