Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации, состоит в
том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата
полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы
субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул
фермента (см. рис. 2, в). Существующие модификации этого метода
различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее
природой.
67
§ 11. Микрокапсулирование
Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чангом (1964). Суть его
состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул,
представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной
стенкой (мембраной) (рис. 9,а). В зависимости от условий получения размер
микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен
микрометров, а толщина мембраны составляет сотые - десятые доли
микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров. Существует два
основных способа получения микрокапсул. В первом из них водный раствор
фермента сначала диспергируется при энергичном перемешивании в диэтиловом
эфире, содержащем ПАВ, которое выступает в роли эмульгатора. К полученной
эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера,
обычно нитрата целлюлозы. При соприкосновении с поверхностью эмульсионных
капель этот полимер, будучи нерастворимым в воде, образует тонкую
оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отделяют центрифугированием
или фильтрованием и промывают.
При втором способе микрокапсулирования образование мембраны на
поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной
поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных
каплях эмульсии, а другой - в объеме органической фазы. Наиболее
распространенными являются полиамидные микрокапсулы, получаемые,
например, путем пбликонденсации 1,6-гексаметилендиамина (водная фаза) и
хлорангидрида себациновой кислоты (органическая фаза). Этот способ
применим только для тех ферментов, которые не инактивируются при высоких
значениях pH, существующих в водных растворах диамина.
Водный раствор фермента, использующийся для получения микрокапсул, должен
содержать инертный белок (обычно гемоглобин) в концентрации около 10%,
который обеспечивает в микрокапсулах необходимое внутреннее давление и
стабилизирует фермент. Для повышения стабильности микрокапсулирован-ного
фермента его нередко подвергают также обработке глу-таровым альдегидом,
приводящей к образованию внутри микрокапсул белковых полимеров. Кроме
того, более высокой стабильности можно добиться, если перед
микрокапсулированием фермент предварительно иммобилизовать путем
адсорбции на носителе, включения в гель или другим способом. J
В некоторых случаях для иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана
которых образована ковалентно сшитыми между собой молекулами инертного
белка. Такие микрокапсулы можно получить, если в методе с применением
поликонденсации в систему не вводить диамин. Тогда хлорангидрид
дикарбоновой кислоты (или другой используемый органораство-
68
^ ' -Л -1 эмульсия вода/масло
c-V
'Л- Р.:- л .S:
¦
. • • . . • , ¦ •• • • , *1 г ••• ¦ '•
["• • * *""• * **13 • • • *7
PflS
г
Рис. 9. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек
(мембран): а - микрокапсулирование; б - двойное эмульгирование; в -
включение в волокиа; г - включение в полые волокна с полупроницаемыми
стенками; д - включение в липоеомы; точками обозначены молекулы фермента;
символами S и Р - субстрат и продукт ферментативной реакции
соответственно
69
римый бифункциональный сшивающий агент) будет образовывать ковалентные
сшивки между молекулами инертного белка, располагающимися на поверхности
водной микрокапли.
§12. Двойное эмульгирование
При иммобилизации методом двойного эмульгирования (Т. Чанг, 1965) сначала
готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе
полимера, точно так же, как было описано для случая получения микрокапсул
первым способом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в воде.
В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора
полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли
водного раствора фермента (рис. 9, б). Через некоторое время органический
раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с
иммобилизованным в них ферментом.
С. Мэй и Н. Ли (1972) предложили модификацию этого способа иммобилизации,
в котором в качестве материала для образования мембраны вместо
водонерастворимого отверждающегося полимера используются жидкие
углеводороды с большой молекулярной массой. Этот метод получил название
иммобилизации путем включения в жидкие мембраны.
§13. Включение в волокна
От микрокапсулирования этот способ иммобилизации, предложенный Д. Динелли
(1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом
случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором - нити. Суть
