Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
имеет вид кривой с минимумом при концентрации сшивки около 5%. При этой
же концентрации сшивки достигается максимальная активность включенного
фермента.
Эффективность включения повышается не только при уменьшении диаметра пор
геля, но и при увеличении размеров ферментной глобулы. Поэтому для
предотвращения вымывания из геля ферменты с небольшой молекулярной массой
иногда перед проведением иммобилизации подвергают обработке глутаровым
альдегидом, в результате которой получаются крупные ковалентно сшитые
белковые агрегаты, прочно удерживаемые полимерной матрицей.
Размеры гелевых частиц. Увеличение концентрации фермента в гел^ не всегда
приводит к соответствующему повышению каталитической активности
иммобилизованного препарата. Дело в том, что при высокой концентрации
фермента весь субстрат перерабатывается уже в поверхностном слое гелевой
частицы, не достигая молекул фермента, расположенных в ее глубине. В
результате каталитический потенциал системы используется не полностью и
общая наблюдаемая удельная активность фермента снижается. (Более
подробное обсуждение этого вопроса см. в гл. IV.) Очевидно, что влияние
этого неблагоприятного эффекта можно ослабить, если использовать
мелкоизмельченный препарат иммобилизованного в геле фермента.
Действительно, скорость реакции, катализируемой р-галактозидазой,
иммобилизованной в геле поли-оксиэтилметакрилата, возрастает при
измельчении геля и достигает максимального значения при уменьшении
диаметра гелевых частиц до 120 мкм, оставаясь затем неизменной.
Рассмотрим некоторые способы получения иммобилизованных в геле ферментов
в форме мелких частиц.
Наиболее простой метод заключается в механическом измельчении блока
полимерного геля путем растирания, продавливания через мелкое сито, а
также гомогенизации (рис. 8,а). Этот метод,
63
гелевый блок
ПАВ
эмульсия вода/масло
'Ъф
полимеризация удаление ПАВ
средний ' диаметр частиц 1-1000 мим
Рис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов в форме
мелких частиц
однако, имеет ряд существенных недостатков. Получаемые частицы обладают
низкой механической прочностью, являются крайне неоднородными по форме и
размерам. Кроме того, молекулы фермента, оказавшиеся при измельчении геля
на поверхности частиц, легко с нее смываются, что приводит к потерям
биокатализатора. Перечисленные недостатки в значительной степени удается
64
преодолеть при использовании эмульсионного способа получения гелевых
частиц (рис. 8, б). В этом случае водный раствор, содержащий фермент,
мономер и инициатор полимеризации, немедленно после приготовления вносят
в неполярный органический растворитель (например, смесь толуола с
хлороформом), содержащий поверхностно-активное вещество (ПАВ), и
полученную смесь интенсивно перемешивают. В результате образуется
эмульсия, состоящая из диспергированных в органической среде капель
водного полимеризующегося раствора, стабилизированных ПАВ. После
окончания полимеризации полученные частицы геля сферической формы
отфильтровывают и отмывают водой от непрореагировавшего мономера и ПАВ. В
зависимости от условий проведения процесса (концентрация мономера,
скорость перемешивания и т. д.) размер получаемых частиц колеблется от
нескольких единиц до сотен микрометров. Одно из преимуществ эмульсионного
способа состоит в том, что благодаря интенсивному тепло-переиосу в
мелкодисперсной системе устраняется опасность инактивации фермента под
действием теплоты, выделяющейся при полимеризации. Сферические гелевые
частицы характеризуются узким распределением по размерам (отклонение от
среднего диаметра составляет ±10%) и высокой механической прочностью,
которая может быть в 10 раз выше, чем в случае частиц, полученных путем
механического измельчения гелевого блока. При использовании эмульсионного
способа необходимо иметь в виду, что некоторые ПАВ, применяемые для
получения стабильных эмульсий, могут вызывать денатурацию фермента.
Полимерные частицы геля еще более мелких размеров (наночастицы), могут
быть изготовлены путем полимеризации в так называемых микроэмульсиях
(рис. 8, в). Здесь используется свойство некоторых ПАВ образовывать в
неполярных органических растворителях обращенные мицеллы, способные
солюбилизовать (растворять) водные растворы мономера и фермента. В
результате солюбилизации формируется микроэмульсия, состоящая из
мельчайших капелек водного раствора, стабилизированных ПАВ. Размер этих
капелек и, соответственно, размер наночастиц, образующихся в процессе
полимеризации, инициируемой облучением ультрафиолетовым светом,
изменяется в зависимости от количества добавленной воды в пределах от
нескольких единиц до нескольких десятков нанометров. Полученные
наночастицы осаждают из органического растворителя ацетоном, отделяют
центрифугированием и высушивают.
Однако применение в технологических реакторах мелких частиц
иммобилизованного биокатализатора не всегда рационально. Например,
излишне мелкие частицы оказывают сильное гидродинамическое сопротивление
