Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
полимерный белок, образующий трехмерную пространственную сетку. Стоимость
иммобилизованного таким образом препарата фермента слишком высока, чтобы
его можно было рекомендовать для технологических целей, однако он
представляет значительный интерес для медицины из-за отсутствия
токсичности и антигенности.
Образование прочных связей между полимерными цепями геля может
достигаться также за счет электростатических взаимодействий. Например, в
присутствии ионов кальция альгинат натрия дает прочный гель, который
широко применяется для иммобилизации ферментов. В этом случае в роли
"мостиков" между полимерными цепями выступают ионы кальция, формирующие
ионные связи с карбоксильными группами альгината. На способности
полиэлектролитов образовывать гели в присутствии поливалентных катионов
основан также метод иммобилизации с использованием синтетического
полиэлектролита - сополимера ма-леинового ангидрида и метилового эфира
винилового спирта.
Интересный способ иммобилизации, основанный на употреблении
полиэлектролитных комплексов, был предложен в 1980 г. В этом случае
фермент модифицируют путем ковалентной пришивки положительно заряженного
N-алкилированного поливинил-пиридина и вносят в водный раствор
полиметакриловой кислоты, несущей отрицательный заряд. В зависимости от
ионной силы
61
и pH среды противоположно заряженные полиэлектролиты могут либо
сосуществовать в растворе, либо образовывать прочный нерастворимый
комплекс, увлекающий фермент в осадок, причем переход между растворимым и
нерастворимым состояниями является обратным и осуществляется в очень
узком диапазоне ионной силы или pH. После завершения ферментативной
реакции, протекающей в гомогенном растворе, фермент переводят в осадок
путем изменения ионной силы или pH и отделяют маточный раствор,
содержащий продукты реакции. Затем осадок вновь переводят в раствор и
повторяют весь процесс сначала.
Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на основе других
синтетических полимеров. Например, при воздействии на водные растворы
поливинилового спирта или поливинил-пирролидона уизлучением или потоком
электронов на полимерных цепях возникают свободные радикалы, при
последующем взаимодействии которых между цепями образуются ковалентные
сшивки. Сшитая полимерная матрица для иммобилизации может быть получена
на основе кремнийорганического полимера поли-диметилсилоксана.
Образование твердого геля происходит в этом случае при введении в
систему, содержащую полимер и фермент, вулканизирующего агента, в
качестве которого применяется окта-ноат двухвалентного олова.
В последнее время все более широкое распространение находит новый метод
иммобилизации ферментов путем их включения в полимерную матрицу из
фотополимеризующихся смол, которые представляют собой олигомеры или
полимеры (макромономеры), содержащие фоточувствительные функциональные
группы. При проведении иммобилизации раствор, содержащий смолу, фермент и
инициатор, в течение нескольких минут облучают ультрафиолетовым светом.
Активированные облучением фоточувствительные группы образуют между собой
ковалентные связи, в результате чего возникает сшитая трехмерная
полимерная сетка с включенными в нее молекулами фермента. Этот способ
иммобилизации обладает тем преимуществом, что свойства получаемых
полимерных гелей можно целенаправленно и в широких пределах варьировать,
подбирая соответствующие макромономеры.
§ 9. Влияние различных факторов
на каталитическую активность ферментов, иммобилизованных путем включения
в гель
Содержание фермента в геле. Каталитическая активность иммобилизованного
препарата возрастает с увеличением количества включенного фермента.
Такого увеличения можно добиться, очевидно, повышая концентрацию фермента
в исходной смеси, используемой для приготовления геля. Следует, однако,
иметь в виду, что растворимость белков в гелеобразующих системах может
быть существенно ниже растворимости в водном буферном растворе.
62
Другой важный фактор, определяющий содержание фермента в геле, - это
структура самого геля, точнее, размер имеющихся в нем пор. Чем меньше
диаметр пор, тем более эффективно фермент удерживается в матрице геля, а
значит, тем выше будет каталитическая активность иммобилизованного
препарата. Пористость геля можно регулировать, изменяя состав исходной
смеси для его получения. Например, плотность гелей, получаемых
полимеризацией производных акриловой кислоты, возрастает с увеличением
исходной концентрации мономера. (Следует помнить, однако, что слишком
высокая концентрация мономера может вызывать денатурацию фермента,
поэтому зависимость удельной каталитической активности иммобилизованного
препарата от исходной концентрации мономера часто проходит через
максимум, который обычно лежит в интервале концентраций мономера 30-60%.)
Размер пор сильно зависит также от концентрации добавляемого в раствор
мономера сшивающего агента. В случае акриловых полимеров эта зависимость
