Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Например, акриламид по своему денатурирующему воздействию на ферменты
близок к мочевине. С другой стороны, полиакриламид этим свойством не
обладает. Именно поэтому обязательной стадией иммобилизации является
тщательная промывка полимерного геля от оставшихся примесей мономера и
инициатора.
Инактивация фермента может происходить под действием свободных радикалов,
образующихся при радикальной полимеризации. Для защиты фермента от
неблагоприятных воздействий в реакционную смесь иногда вводят
стабилизирующие добавки. В роли таких добавок могут выступать, например,
инертные белки (обычно альбумин) или вещества, являющиеся субстратами или
продуктами реакции, катализируемой данным ферментом.
Неорганические гели. Для иммобилизации ферментов может быть использован
гель поликремниевой кислоты (силикагель), который представляет собой
продукт поликонденсации монокрем-
59
ниевой кислоты Si (ОН) 4- Методика иммобилизации состоит в том, что в
золь кремниевой кислоты (полученный, например, путем гидролиза
кремнийорганического соединения) добавляют раствор фермента. Через
несколько часов в результате самопроизвольной полимеризации образуется
гель, представляющий собой трехмерную сетку из атомов кремния,
соединенных кислородными мостиками. Полученный гель высушивают,
измельчают и отмывают от невключившегося фермента.
Иногда для иммобилизации ферментов применяют гель фосфата кальция. В этом
случае образование пространственной сетки обусловлено не ковалентными, а
ионными связями.
§ 8. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров
Несшитые полимерные гели. Этот способ иммобилизации основан на свойстве
природных полисахаридов, таких, как крахмал, агар-агар, каррагинан и
агароза, образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов.
Методика состоит в том, что водную суспензию полисахарида нагревают до
температуры 80-90°С, добиваясь его полного растворения, и полученный
горячий раствор медленно охлаждают. Непосредственно перед началом
гелеобразования (обычно между 30 и 50°С) в систему добавляют водный
раствор фермента. При дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий
иммобилизованный фермент. Для улучшения механических свойств
иммобилизованного препарата процесс гелеобразования иногда проводят в
порах вспененного полиуретана.
Другим природным полимером, широко применяемым для иммобилизации
ферментов, является коллаген - фибриллярный белок соединительной ткани
животных. Существует три основных способа иммобилизации ферментов с
помощью коллагена: макромолекулярное комплексообразование,
импрегнирование и электроосаждение. При макромолекулярном
комплексообразова-нии коллаген диспергирует в водном растворе при низких
(2,0- 4,5) или высоких (8,5-12,0) значениях pH, вносят фермент и
инкубируют смесь в течение 15-20 ч. Затем раствор выливают тонким слоем
на инертную подложку и высушивают. В результате получается
ферментсодержащая белковая мембрана, имеющая структуру трехмерной сетки
из переплетенных фибрилл коллагена. Способ макромолекулярного
комплексообразования неприменим для иммобилизации ферментов, неустойчивых
в кислых или щелочных растворах, поскольку он требует длительной
инкубации фермента в среде с экстремальными значениями pH. Этого
затруднения можно избежать, если проводить иммобилизацию методом
импрегнирования, при котором раствором фермента пропитывают уже готовую
коллагеновую мембрану.
При иммобилизации методом электроосаждения смесь дисперсии коллагена и
раствора фермента помещают между элект-
60
родами и включают электрический ток. Под действием электрического поля
молекулы коллагена и фермента мигрируют в направлении одного из
электродов (в зависимости от pH раствора) и осаждаются на его поверхности
в виде мембраны. Этот способ удобен тем, что позволяет получать мембраны
заданной толщины и конфигурации при высокой общей скорости процесса.
Последнее обстоятельство особенно важно, поскольку снижает вероятность
инактивации фермента под действием неблагоприятных значений pH.
Сшитые полимерные гели. Введение ковалентных сшивок позволяет добиться
повышения механической прочности полимерных матриц и более прочного
удерживания включенного в них фермента. Образование сшивок между
полимерными цепями достигается, например, при обработке бифункциональными
реагентами, способными взаимодействовать с функциональными группами
полимера. Так, для обработки коллагеновых мембран применяется глутаровый
альдегид, который используется также при получении сшитых матриц для
иммобилизации на основе других белков. Обработке бифункциональными
сшивающими реагентами могут подвергаться и полисахаридные гели,
рассмотренные ранее.
Существует также способ включения ферментов в сшитую белковую матрицу,
основанный на использовании системы фибриноген-тромбин. При этом способе
иммобилизации к раствору фибриногена и фермента в водном буфере добавляют
белок тромбин, под действием которого фибриноген превращается в фибрин -
