Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
(11.1)
dT ~ RT2 ’
ИЛИ
d\r\K
ДЯ R '
(11.2)
-RT\nK,
можно найти величину энтропии процесса
(П-Ч)
(11.4)
В этом случае для корректной обработки температурной зависимости реакции необходимо учитывать теплоты ионизации ионогенных групп субстрата или активного центра фермента.
Все вышеприведенные рассуждения в равной мере относятся и к анализу температурных зависимостей кинетических параметров ферментативных реакций, которые зачастую представляют собой комбинации констант скоростей «индивидуальных» процессов, в свою очередь обычно зависящих от pH среды. Поэтому изучение температурных зависимостей имеет действительную ценность в тех случаях, когда известен механизм протекания реакции и установлена его лимитирующая стадия.
На практике анализ зависимостей констант скоростей ферментативных реакций от температуры проводится аналогично анализу температурных зависимостей неферментативных реакций (ем. гл. 4). Однако зачастую для реакций, катализируемых ферментами, график в координатах (In k, l/Т) или (In k/T, 1 /Т) имеет вид линии с изломами. Наличие подобных изломов на аррениусовской зависимости можно объяснить как сменой лимитирующей стадии реакции при изменении температуры, так и переходом активного центра молекулы фермента в узком температурном интервале в другое конформационное состояние со сменой активационных параметров реакции.
Особенностью ферментативных реакций является тгкже наличие колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком интервале, которая характеризуется «тем пературным оптимумом» реакции. Эта особенность объясняется наложением двух эффектов — возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при достаточно высоких температурах. При достаточно корректной постановке эксперимента оба эти явления можно изучать раздельно.
§ 2. Изучение термодинамики конформационных изменений активных центров ферментов
Изучение термодинамики обратимых конформационных переходов в белках можно проводить на основе уравнения Вант-Гоффа
(11.1) — (П-2), исследуя температурную зависимость константы равновесия процесса. Однако существуют подходы, позволяющие изучать термодинамику равновесных процессов с помощью кинетических методов. Один из них основан на изучении влияния температуры на кинетику инактивации ферментов под действием ультразвука [1]. Рассмотрим кинетическую схему (11.5) инактивации двух молекул фермента, отличающихся конформацией активного центра и находящихся друг с другом в равновесии. Естественно полагать, что вследствие различной конформации активных центров молекул фермента Е и Е' кинетика их инактивации также будет
различной, характеризуясь константами скоростей инактивации k\ и kz'. s
F : " F/ (П-5)
fri
Продукты инактивации фермента
Рассмотрим, как с помощью изучения температурной зависимости эффективной константы скорости инактивации можно рассчитать термодинамические параметры АН и AS, характеризующие обратимые конформациочные изменения активных центров ферментов. Общая скорость инактивации фермента, как следует из схемы
(11.5), определяется выражением
v = k1 [Е] + k2 [E'J.
На основании уравнения материального баланса
[Е]0 = [Е] + [Е']
и выражения для константы равновгсия процгсса можно записать
k\ [Е]0 k2 [Е]0/? v~ 1 hK+ 1 + К '
или
“V — кэфф [Е]0,
где
Лвфф = ^^- (1К6)
Выражение (11.6) устанавливает связь между эффективной константой скорости инактивации фермента и константой равновесия
(11.5), зависящей, согласно уравнению Вант-Гоффа, от температуры (при АНФО). Дифференцируя обе части выражения (11.6) по Т (считая k\ и k2 постоянными, так как конформационные переходы активных центров ферментов происходят, как правило, в довольно узком температурном интервале), получаем
^Эфф ^2 йК
dT — (1 + К)2 ' ~йТ'
Из уравнения (11.7) следует, что скорость изменения &Эфф с температурой в точке К= 1 (при температуре Тс) равна
^эфф — kx йК
ат 4 'Чт-
Наконец, преобразуя уравнение Вант-Гоффа
(11.7)
(11.8)
A I—T RT2 dK m ш
АН = ~К-ат- (1L9>
и подставляя выражение (11.8) в (11.9), найдем выражение для энтальпии конформадконного перехода в точке Т—Тс (рис. 112):
Зная АН >конформационвого перехода, по формулам (11.3) и (11.4) можно найти значения свободной энергии и энтропии данного процесса при температуре Тс.
