Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
k-Ms
Кт( как) , , [Н+] , Кь •
+ Ка Н [Н+]
(10.22)
(10.23)
(10.24)
Выражениям (10.22) - (10.24) соответствует следующая схема pH -зависимости:
к„
Н,
i KS к.
EH + S -----------------------------»• EHS----------------------' EH -j Р
«'ь
Е + S
ES
Здесь р/(а=6,40;- рКъ=8,35; рК'ъ=8,25 (см. рис 109).
10-14. Решается аналогично задаче 10-9 (рис. 110).
Ответ: рКа=6,85; рКъ = 9,04; (?2/tfs)iim=3940 М^-сек-1.
10-15. Решается аналогично задаче 10-4.
Ответ: рКа = 4,46; (&кат/Дт(каж))ит::=3* 105 М-1 • сек-1; рК'а=:
=4,13; (/eKaT)iim= 192 сек-'.
10-16. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: рКа=6,89; рКь—9,01; (fts/A's)nm=3350 М-'-сек-1.
10-17. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: рКа== 1,17; рКь^= 4,35; (&кат//СТО{Каж))нт==32,5 JV1 *¦
10-18. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: р/(а=3,56; рКь == 8,07; (^кат/^Ст(каж)) iim=
10-19. Обрабатывая экспериментальные данные (табл. 19) обычным способом, находим, что величина &Кат зависит от состояния двух ионогенных групп фермент-субстратного промежуточного соединения с рК'а~6,7 и рК'ъ—9,5 и &Кат/^Ст(каж) зависит от состояния одной ионогенной группы свободного фермента с рКа=7,1-Для данной ферментативной реакции стадией, лимитирующей скорость гидролиза, является ацилирование (&2<§;&з), поэтому фор-
•сек
—1
мально-кинетически реакцию можно рассматривать как дв"\ста дийнук, И k
н+
1 + —-г- +
к
‘'а
k2/Ks
Ki,
[Н+]
к
т (каж)
к
т (каж):
К S
1 +
1 +
[Н+] •
Ка
[Н+]
Ка
1Н+] К'„
1 + 7Г' +
(10.25)
(10.26) (10.27)
К.
[Н+]
Рис. 109. Определение констант ионизации ионогенных групп активного центра клострипаина, контролирующих реакцию гидролиза
Рис. 110. Профиль pH-зависимости ацилирования а-химотрипсина п-нитрофе-нилацетатом; кривая является теоретической для рЬС„=6,85; рКь=9,04;
(fe2/Ks)iim=3940 М-'-сек-1
Выражениям (10.25) — (10.27) соответствует следующая схема pH-зависимости ферментативной реакции:
ЕН2 + S ;—" ЕН2 S
к-
'<S
EH + S
1<а
EHS -
К-'ь
I
ES
^Е + Р
(10.28)
Схема (10.28) может быть интерпретирована таким образом, что субстрат при связывании индуцирует каталитически неактивное конформационное состояние фермента, концентрация которого регулируется ионогенной группой с константой диссоциации К'ь-
10-20. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: р/Са=5,0; рКъ=8,0.
10-21. Согласно условию задачи, схема pH-зависимости реакции должна включать два ионных состояния фермента — протони-рованное (неактивное) и депротонированное (активное) и два состояния субстрата — нейтральное (активное) и отрицательно заряженное (неактивное). Условию задачи могут удовлетворять два основных варианта реакции: (а) анион субстрата образует нереакционный фермент-субстратный комплекс и (б) анион субстрата не связывается с ферментом. Рассмотрим сначала более общий случай (а)
(10.29)
Е + Р
Кинетическая обработка схемы (10.29) проводится обычным способом. Запишем уравнение скорости реакции, уравнения материального баланса по ферменту и субстрату (принимая [Е]0<С -С [S] о) и выражения для констант равновесия
w = ?2[ESH], (10.30)
[Е]0 = [Е] + [EH] + [ESH] + [EHSH] + [ES“] + [EHS~], (10.31)
[S]0 = [S~] + [SH], (10.32)
у [Е] [SH] jr [Е] [S ] /1^. от
As= [ESH] ’ As~= [ES"] ’ (Ю-3^
у [E] [H+]. K, [ESH] [H+] 10 34>
Ka [EH] ’ [EHSH] ( '
IS" [ES ] [H+] . ^ [S J [H+]
a ' [EHS~] ’ c [SH] ¦ (10.3b)
