Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Ответы и решения
10-1. Экспериментальные данные pH-зависимости (табл. 1) согласуются с величиной рКа=6,85 и предельным значением каталитической константы (&кат)ит= 152 сек'1 (рис. 105).
10-2. Решается аналогично задачам 3-2—3-4, или 10-1 (рис. 106).
Ответ: рКи = 7,15.
6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 pH {
Рнс. 105. рН-Завнсимость каталитической константы скорости гидролиза этилового эфира N-ацетил-L-тирозина, катализируемого а-химотрипсином; кривая является теоретической с рК„=6,85
Рис. 106. Определение значения рКа ионогенной группы активного центра фермента из кривой рН-зависимости деацилирования транс-циннамоил-химотрипсина
10-3. Для определения рК иоиогенной группы, относящейся к свободной форме фермента, следует анализировать график в координатах (йкат/Ктпскаж), pH). Обработка экспериментальных данных pH-зависимости производится аналогично решениям задач 10-1, 10-2.
Ответ: рКа=7,1.
10-4. Обрабатывая данные pH-зависимости обычным способом, находим значения рК ионогенных групп, равные 7,1 и 6,4 для свободного фермента и фермент субстратного комплекса соответственно. Так как величины рК, для этих двух форм фермента различны,
то экспериментальные данные можно описать следующей простейшей схемой рН-зависимоети
к,
ЁЙ + S “2 EHS —% ЕН + Р. (10.21)
Из анализа схемы (10.21) можно получить следующие выражения для эффективных кинетических и равновесных параметров:
ь _ _______
кат
. ILLH ’
Ка
Г _ г 1 + [Н+]!Ка
k2IK
s
Кщ (каж) + [Н+ ЦКа
Ответ: рКа=7,1; р/('а=6,4; /г2=0,032 сек-1; /e2//Cs= 16,4
М-1 - сек-1; Ks= 1,95- 10-3 М.
10-5. Решается аналогично задаче 10-2.
Ответ: рКа—7,2.
10-6. Решается аналогично задаче 10-4.
Ответ: схема pH-зависимости идентична схеме (10.21); рКа= = 7,0; рК'а=6,1.
10-7. Решается аналогично задаче 10-2.
Ответ: рКа=3,5.
10-8. Решается аналогично задаче 10-2.
Ответ: рКа—8,3; &инакт= ИЮ М-1 • сек-1.
10-9. Данные табл. 9 можно описать следующим выражением pH-зависимости константы скорости второго порядка ферментативной реакции
*к.т____________
^т-(как) , Х [Н + ] , Kb
1 + Ка + [Н+]
где Ка и Кь — константы диссоциации ионогенных групп свободного фермента, контролирующих реакцию.
Для определения значений Ка и Кь можно применить обычный Метод обработки колоколообразных кривых pH-зависимости — сначала построить профиль pH-зависимости в логарифмических координатах (log ?кат/^(т(каж), pH) и оценить приближенно значения рКа, рКь и k2/Ks (рис. 107), а затем провести коррекцию найденных значений констант до оптимального согласования теоретиче-
ски рассчитанной кривой с экспериментальными результатами (рис. 108).
Ответ: рКа=4,3; рКь — 8,2.
10-10. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: рКа=6,55; рКъ=9,23; (&Кат)пт=4,76-10~2 сек-1.
10-11. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: рКа=5,8; рКь — 8,0; (Fmax)iim=3,08-10-4 моль/мин-мг
белка.
10-12. Решается аналогично задаче 10-9.
Ответ: рКа—7,16; рКь = 8,90; (&кат)шп=5,08-10~2 сек-'.
k -f -г
, М cew
т{наю
40 50 6,0 7,0 8,0 9,0
pH
Рис. 107. Приблизительная оценка значений констант диссоциации ионо-генных групп активного центра па-панна в реакции гидролиза п-нитро-анилнда 1\]-бензоил-Ь-арпшина
Рнс. 108. Иллюстрация подбора теоретической кривой рН-зависн-мости, списывающей экспериментальные данные по влиянию pH на гидролиз, катализируемый папаином. Пунктирная кривая рассчитана с использованием значений рКа=4,5; р/Сь=8,4; k2IKs = =251 М_1-сек-1 (найденных из рис. 107). Сплошная кривая рассчитана с использованием значений р/Со=4,3; /Жь =8,2; kz!Ks — = 251 М-'-сек-'
10-13. Значения констант ионизации можно определить построением экспериментальных данных в логарифмических координатах (log ?кат//(т(каж), pH); (log?KaT, pH) и проведением к ветвям pH-зависимости касательных с угловыми коэффициентами, равными + 1,0 и —1. Проекция точек пересечений касательных на ось абсцисс даст значения рКа, рКь и рК'ь (рис. 109). Форма кривых pH-зависимости согласуется со следующими выражениями для
k ------
^каг
1 +
Кт (каж) — К S'
Кь
[Н+!
jh+L
1 ¦ Ка + [Н+]
1 +
Кь
[Н+]
