Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Комбинируя выражения (10.2) и (10.3) с выражениями для
констант равновесия, получим общее уравнение скорости ферментативной реакции
___ ^кат [E]q-[S]0 ПО 41
где
*кат =----------*-----пт-, (Ю.5)
[Н+] Кь
+ К'а +[н+]
к'а т [Н+]
Из выражений (10.5) — (10.6) видно, что анализ зависимости &Кат от pH позволяет найти значения констант диссоциации групп фер-мент-субстратного комплекса (К'а и К'ъ), а анализ рН-зависимо-СТИ константы скорости второго порядка &кат//(т(каж) приводит к значениям констант диссоциации ионогенных групп свободного фермента Ка и Кь-
Если субстрат, связываясь с ферментом, не изменяет значений констант диссоциации ионогенных групп активного центра (Ка— — К'а, Къ=К'ь на схеме 10.1), то в этом случае константа Михаэлиса ферментативной реакции не зависит от pH
- [Н+]2, ЖГ~ [EMSJ°
+ [Н+1
---------• (la7>
Практически это может означать, что ионогенные группы, контролирующие ферментативную реакцию, входят в состав каталитического, а не сорбционного участка активного центра.
Если активный центр свободного фермента имеет две ионогенные группы, ионизация которых переводит фермент в неактивную форму, не способную связывать субстрат (К'а = оо, К'ъ — 0),
ЕН2
t
*s *
Eft + EHS —--EH + P
I
E
то уравнение скорости ферментативной реакции приобретает следующий вид:
* =------7----M_E]o-[S]o ----------_ (10.8)
Ч,+л?1г + тетг) + '51-
Зависимость скорости ферментативной реакции от pH типа (10.8) может соответствовать случаю, когда ионогенные группы активного центра входят в состав сорбционного участка фермента, и не принимают участие в последующей каталитической стадии.
Очевидно, что уравнения (10.7) и (10.8) описывают симметричную колоколообразную кривую pH-зависимости скорости ферментативной реакции (при небольшой концентрации субстрата в случае 10.8). Однако на практике иногда наблюдаются колоколообразные кривые зависимости скорости ферментативной реакции от pH. Для их описания необходимо учитывать возможность нескольких ступеней ионизации активной формы фермента в кислую или щелочную сторону. Например, схеме (10.9) соответствует уравнение (10.10) скорости ферментативной реакции, согласно которому график В координатах (10g&KaT, pH) ИЛИ (log &кат/Кт(каж), pH) имеет вид соединенных плавными переходами отрезков с тангенсами угла наклона +2, +1, 0, —1, так что общий график рН-зави-симости имеет вид несимметричной колоколообразной кривой, левая ветвь которой круче правой:
EHg + S :-----* EH3S
EH2 + S -—-» EH2S
+ S
Kb
ES
(10.9)
EH + P
•v = ¦
1+-
[H+] [H+p
K'h
+
K?
KaK
r +'
[E]o [S],
[H+]
1 +
K<
Kb + KaKb T '[H+]
+
Kc
1+-
[H-u [H+]*
K'h
¦ +
+ ¦
К
KaKb [H+]
+ [S]„
(10.10)
§ 2. pH-Зависимости трехстадийной ферментативной реакции
В общем виде схему pH-зависимости трехстадийной ферментативной реакции с двумя ступенями ионизации можно записать следующим образом:
ЕН+ S
E + S
fco ko
¦ EH2S—^EH2A- 3
EH, + P,
EH + P„
EtPs
(10.11)
Полная обработка данной схемы приводит к довольно сложным выражениям для кинетических параметров /гкат и /Ст(каж) ферментативной реакции. Однако на практике pH-зависимость ферментативных реакций, протекающих по трехстадийному механизму, имеет более простой вид. Как правило, ряд протонированных или денротонированных состояний фермента или не обладают способностью связывать субстрат, или не вступают в реакции ацилирования или деацилирования, что приводит к упрощениям соответствующих схем pH-зависимости. Например, в реакциях гидролиза специфических субстратов, катализируемых а-химотрипсином и трипсином, схема (10.11) упрощается:
ЕН0
EH + S
EH2S
ен2а
г | п
У «а Ка
EHS - 'ЕНА + ЕН
(10.12)
В этом случае уравнение скорости реакции имеет вид
&2
(14-
[H+] '
К'
+
(, + ^)
[E]0-[S]0
‘V =
[н+]
Ка
Кь
[Н+]
* [ К I
+ [S].
(10.13)
и эффективные индивидуальные константы ферментативной реакции, зависящие от pH fft2, *з и Rs), определяются следующими выражениями.
kz
[11+
к'
h=
i +
