Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Ks = Ks-
1 +
[H+]
«a
[H+]
(10.14)
Кь
1 +
[H+l
K'
Из уравнения (10.13) видно, что рН-за висимость скорости ферментативной реакции, протекающей по трехстадийной схеме, в общем случае будет различной в зависимости от соотношения констант скоростей стадий ацилирования и деацилирования (k2/k3). С другой стороны, рН-записимость константы скорости второго порядка &кат/К?п(каш), как и для двухстадийной схемы (10.1), определяется только константами диссоциации ионогенных групп активного центра свободного фермента (Ка и Кь), контролирующих дальнейшее превращение фермент-субстратного комплекса.
§ 3. Ионизация субстрата
В тех случаях, когда и фермент, и субстрат имеют в своем составе ионогенные группы, протонирование или депротонирование которых влияет на скорость ферментативной реакции, обработка соответствующих схем pH-зависимости существенно усложняется. Схема (10.15) иллюстрирует двухстадийную ферментативную реакцию, в которой активный центр фермента имеет две ионогенные группы (с константами диссоциации Ка и Кь в свободной форме фермента), и две формы субстрата находятся в прототропном равновесии друг с другом (с константой диссоциации К с)
EH -f- Р
ESH
(10.15)
EH..S
'к.
EH + Р
Если из трех ионизационных состояний фермента лишь одно является активным, и обе формы субстрата являются реакционноспо-
собными (схема 10.15), скорость ферментативной реакции определяется обычным выражением
^кат [Е]р IS],
где
(каж) + [S], ’ ^2H^S
•^SH Ке
(,+
[Н+]
к'
К
+
[Н+]
\ Ks[H+] / ') + KSH-Kc \
Кь
К
т (каж)
Ks
(
[Н+]
i +V- +
1 +
[Н+]
к''
+'¦
к;
[Н+]
[Н+]
\ к. [Н+11
+
Ksl н+]
К sh Кс
1 +
[Н+]
к:
¦+
к;
[Н+]
Более часто встречается случай, когда из двух форм субстрата лишь одна связывается с ферментом или вступает в ферментативную реакцию, приводя к продукту. Например, если в ферментативной системе, описываемой схемой (10.16), субстрат претерпевает ионизацию, причем из двух форм субстрата — нейтральной и отрицательно заряженной — лишь нейтральная форма связывается с ферментом, го скорость ферментативной реакции будет определяться выражением (10.18)
EH2+S
EH + S
EH2S
HS
Kh
-ЕН + Р
(10.16)
E + S
ES
S- + н+.
1 +
[Нн
V
Ка
Кь
[Н+]
[?]о [S],
1 +
Кс
[Н+]
) + [S3»
(10.17)
(10.18)
Вывод выражения (10.18) отличается от вывода (10.7) лишь введением уравнения материального баланса по субстрату, [S] о= = [S] + [S-]. Из сравнения выражений (10.7) и (10.18) очевидно, что ионизация субстрата приводит к зависимости значения /С?П(каш) от pH, анализ которой позволяет найти константу диссоциации субстрата Кс.
В том случае, если субстрат имеет две ступени ионизации
-н+ -н+
выражения для &Кат и Кт(каж) в уравнении скорости ферментативной реакции, протекающей по схеме (10.16), будут иметь вид
§ 4. Нахождение значений рК по кривым pH-зависимостей ферментативных реакций
Нахождение значений рК ионогенных групп фермента (или субстрата), контролирующих скорость реакции, по профилям зависимости кинетических параметров ферментативной реакции от pH производится по тем же правилам, что и при обработке рН-зави-еимостей неферментативных реакций (см. гл. 3). Например, логарифмируя левую и правую части выражения (10.14), получим
Очевидно, что при [Н+] Ка значение log k2 не зависит от pH и равно логарифму константы скорости ацилирования. Если же
т. е. логарифм эффективной константы скорости ацилирования изменяется пропорционально pH. На основании подобных представлений можно легко показать, что графики зависимостей логарифмов кинетических параметров ферментативной реакции от pH должны иметь вид прямолинейных отрезков, соединенных плавными переходными участками (см. гл. 3). Экстраполяция линейных участков до пересечения их друг с другом дает величины рК ионогенных групп, контролирующих изменения данных кинетических (или равновесных) параметров ферментативной реакции.
Основным способом проверки и уточнения найденных значений рК (в случаях кривых pH-зависимости любой формы) является
, [Н+] Кь
V 4“ ГЫ+'
Ка ^ [Н+]
[Н+] » К'а, ТО
log %2 = log k2 — рКа + pH
проведение теоретической кривой pH-зависимости и коррекция ее вплоть до оптимального согласования с результатами эксперимента.
