Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Наконец, величину Kv можно также определить, если из независимого эксперимента (при использовании начальных скоростей реакции) найти значения Vm и Кт(кат) ферментативной реакции и сопоставить их со значениями эффективных кинетических параметров, найденных из полной кинетической кривой при ингибирующем действии продукта реакции.
§ 3. Инактивация фермента в ходе реакции
При изучении кинетики ферментативных реакций, протекающих до высоких степеней превращения субстрата, необходимо принимать в расчет возможность инактивации фермента в ходе реак-
ции. В ряде случаев было найдено, что связывание субстрата с ферментом ускоряет инактивацию последнего; иногда субстрат не оказывает влияние на инактивацию фермента. Однако чаще всего сзязывание субстрата предохраняет фермент от инактивации, т. е. фермент-субстратный комплекс инактивируется медленнее, чем свободный фермент.
Рассмотрим в качестве примера схему реакции, в которой субстрат полностью предохраняет фермент от инактивации, в то время как свободный фермент денатурирует с константой скорости инактивации первого порядка /гин
1<S
E + S Е + Р. (8.10)
Неактивный фермент
Если [Е*]0 — общая текущая концентрация активного фермента в системе (8.10), то можно записать
[E*]0=[E] + [ES] (8.11)
-^-A„([E4-[ES]). (8.12)
Из схемы (8.10) следует, что скорость расходования субстрата определяется выражением
^ -Jfe,[ES] (8-13)
или, учитывая соотношение
(8.14)
имеем
- «Е*Ь - [ES]) [S]. (8.15)
Разделив уравнение (8.12) на (8.15), получаем
d[E*]„ К$&ин ~ЩЩ~ [S]
или
л Ks^hh d[S] й 1R
dlE ]«> = -*;-----W (8‘6)
Интегрируя уравнение (8.16) при начальных условиях [Е*]0=[Е]0 при [S] = [S]0,
[Е*Ь „ . [S1
К с К
получаем
[Е*]0= [Е]0 - In (8.17)
Из полученного выражения следует, что количество непрореагиро-
вавшего субстрата в системе после прекращения реакции (вследствие полной инактивации фермента, при [Е*]0=0) равно
_ к, [Е]о
[S] = [S]0e (8.18)
Если из независимого эксперимента (при исполезогвании на-
чальных скоростей ферментативной реакции) определить значения ^2 и Ks, то, зная начальные концентрации субстрата и фермента и долю субстрата, прореагировавшего до прекращения реакции, из соотношения (8.18) можно рассчитать константу скорости инактивации фермента в условиях опыта.
Комбинируя выражения (8.11), (8.13) и (8.14), получим дифференциальное уравнение скорости ферментативной реакции
a&[sj /i2 [e*]q [Sj R
dt Ks+[S]' ' ^
Подставляя выражение (8.17) в (8.19), получим
d[S] *.g]. [S] Ks [S]km*. [S],
----ЧГ = Ks ? [SI ~ Ks + [S] ln (S)
Вводя вспомогательную переменную z, связанную с [S] зависимостью
^
~ ' [SI. •
где
„ __ ki [Е]0 ^ин К s'
преобразуем уравнение (8.20) к более простому виду
dz KskK4zlnz
dt Ks+[S],e-«z-
(8.21)
Интегрирование уравнения (8.21) "при начальных условиях z = еч при t = 0 приводит к выражению
In
1 [S]0<?-<7 Г dz
I_____г [S] Ks кии
Я [S],
где ^ ----табличный интеграл, равный
С dz , , . . . (1п2)2 .
!)Т1Г7 = 1п1п-+1пг+W +
(In zy
3-3)
Подставляя в выражение (8.22) известные значения констант k2, Лин, Ks и начальные концентрации [Е]о, [S]0, можно рассчитать, какое количество субстрата превратится в продукт под действием фермента за определенное время t. Из выражения (8.22) также можно рассчитать время, за которое ферментативная реакция пройдет до заданной степени превращения субстрата.
Задачи
8-1. Найти значения точек пересечения на координатных осях и угловых коэффициентов прямых при линеаризации интегральной формы уравнения скорости ферментативной реакции в координатах
1 1П [S]q ¦ t - t [S]„— [P] ’
6) L _LIn_tsi._.
ГР1 > ГР1 1
в)
[Pj' [PJ [S]0— [P] ’ [P]
. [Sj. • [n [S], •
ln[S)c-[P] ln [S]0 -[P]
(Ъ-2уТ1ри изучении кинетики гидролиза амида М-ацетил-Ь-гек-сагйДрофенилаланина, катализируемого а-химотрипсином, эксперимент ставили следующим образом. Меняя начальную концентрацию субстрата, определяли концентрацию продукта, образовавшегося через 1 ч после начала ферментативной реакции [4]. На основании данных табл. I определить кинетические параметры (/гкат и /Ст(каио) реакции.
