Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
70 41,3
4С0 31,2
2) Предложить графический способ определения констант /г_3 и КР для реакции (7.19), основанный на измерении эффективной константы скорости установления равновесия в системе при различных концентрациях свободной кислоты.
Ответы и решения
7-1. Так как все исследуемые субстраты а-химотрипсина (табл. 1) имеют одинаковую ацильную часть, то константа скорости деацилирования (/г3) имеет для них одинаковое значение, равное 300 сек-1 (для л-нитрофенилового эфира kvaT—ks, поскольку для этого субстрата стадия деацилирования лимитирует скорость ферментативного гидролиза). Используя соотношение (7.2) и данные табл. 1, можно вычислить значения k2 для ряда субстратов (для л-нитрофенилового эфира можно указать лишь нижний предел величины k2).
Ответ: для амида й2=0,24 сек-1; /г3=300 сек-1; для этилового эфира /г2=600 сек-1; /г3=300 сек-1; для л-нитрофенилового эфира й2>3000 сек-1; й3=300 сек-1.
7-2. Так как для n-нитрофенилового и ж-нитрофенилового эфиров .Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аланина значения каталитической константы не зависят от структуры уходящей группы, можно полагать. что для этих субстратов йкат = й3. Учитывая, что значение k3 постоянно для всего исследуемого ряда субстратов (см. решение предыдущей задачи), находим значения k2 и Ks с помощью соотношений (7.2), (7.3) и (7.11).
Ответ: (результаты округлены с учетом точности вычислений): Для всех субстратов й3=120 сек-1; Ks= Ю~3 М; для л-нитрофе-нилсвого эфира ?2=800 сек-1; для ж-нитрофенилового эфира k2=
— 750 сек-1; для о-нитрофенйлового эфира /г2=50 сек-1; для фени-лового эфира k2=270 сек-1.
7-3. Для вывода уравнения скорости, связывающего значения кинетических параметров ферментативной реакции (7.17), протекающей в стационарном режиме (при [S]o3>[E]o), с концентрацией добавленного ингибитора (ионов Си++) запишем уравнение материального баланса по ферменту
[Е]0 = [EJ + [ES] + |ЕА] + [IE] + [IES], (7.20)
выражения для констант диссоциации фермент-субстратного и фер-мент-ингибитсрного комплексов
a's=J1e1L’ <7-21>
(7.22)
выражение для скорости образования продукта Р2
v = k3 [ЕА] (7.23)
и условие стационарности концентрации ацилфермента в ходе реакции
^ = k2 [ES] - къ [ЕА] = 0. (7.24)
Комбинируя выражения (7.20) - (7.24), получаем уравнение скорости ферментативной реакции в присутствии ионов Си++
*кат [Е], [S]o
Vi~' <(«.*)+ [S]o ’
где
hi _ k*____________
кат i , A Ж ’
+ *з + Kl Ki...... ¦ Ks ’’
m
m (каж) k9 [I] ’
1 + *3 + Kl
Из выражения (7.25) видно, что тангенс угла наклона зависимости в координатах (l/?j,aT, [I]) равен \jk2K\ (рис. 73):
___1__= j__________L_ _|__П] /у 25)
kl кг ^ къ + k2Ki ' [ ' ’
кат
Значение константы ингибирования (/(i) ферментативной активности ионами меди можно найти линеаризацией экспериментальных
данных в координатах (Л',п(каж) /к*кат, [I]) (рис. 74). Определив таким образом значение k2, из выражений (7.2) и (7.3) легко можно найти значения констант k3 и Ks-
Ответ: &2=320 сек1—, /е3=120 сек-1; Ks=9,7 • lCh5 М.
7-4. Так как изменение ионной силы раствора избирательно влияет лишь на константу скорости ацилирования, для раздельного определения индивидуальных констант ферментативной реакции удобно применить метод, описанный в § 2 настоящей главы. Согласно этому методу, в координатах Лайнуивера-Берка семейство
Рис. 73. Обработка результатов экс- Рис. 74. Определение констан
перимеита по ингибированию попами ты ингибирования а-хнмотрип-
меди гидролиза этилового эфира сипа ионами меди в реакции
М-бензоил-Ь-тирозииа, катализируемо- гидролиза этилового эфира
го а-химотрппсипом К-бензоил-Ь-тирозина
прямых (l/v, l/[S]o), полученных при различных значениях ионной силы раствора, пересекается в левом верхнем квадранте с абсциссой общей точки пересечения, равной 1/[S]0=—1/Ks- Таким образом, для нахождения величины Ks необходимо воссоздать ход прямых зависимости 1 Jv от соответствующих различным значе-
ниям ионной силы раствора. Это можно сделать, если учесть, что в координатах Лайнуивера-Берка прямая ([E]o/f, l/[S]o) отсекает на оси ординат и абсцисс отрезки 1//екат и —1/Км(к&ж) (Рис- 75). Определив таким образом величину Ks, из соотношения (7.11) находим значения k2tk3.
Ответ: /<s=0,4M независимо от ионной силы раствора; при [KCI] =0,1 М; №=2,7; при [KCI] =2,7 М; k2lk3=23.
