Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
7-5. Для нахождения значений индивидуальных констант ферментативной реакции удобно применить метод, описанный § 3 настоящей главы. Согласно данному методу, в координатах Лайнуи-вера-Берка прямые, соответствующие различным концентрациям дополнительного нуклеофильного агента, пересекаются в левом
верхнем квадранте с абсциссой общей точки пересечения, равной l/[S]o= — 1/tfs. Определив таким образом величину Ks (рис. 76), из соотношений (7.2) и (7.3) можно найти значения констант k2 и h-
Ответ• й2=260 сек-1; й3=68 сек-1; /(s=5-10_2M.
Рис. 75. Определение истинной константы Михаэлиса в реакции гидролиза метилового эфира N-ацетил - L -в алина, катализир уемого а-химотрипсином, при селективном влиянии ионной силы раствора на константу скорости ацилнрованпя фермента. Концентрации KCI: а — 0,1 М- 6 — 0,3 М; в —0,5 М; г — 0,8 М д—1,0 М; е— 1,5 М: ж — 2.0 М; з — 2,7 М
Рис. 76. Определение индивидуальных констант скоростей гидролиза этилового эфира L-тнрозина, катализируемого а-химотрипсп-ном, в присутствии дополнительного нуклеофильного агента, 1,4-бу-тандиола. Концентрации 1,4 бутан -днола: а — 0; б — 0,11 М; в — 22 М
Рис. 77. Влняние дополнительного нуклеофильного агента, метанола, на кинетику гидролиза метилового эфира 1Ч-ацетил-Ь-фенш1 аланина, катализируемого трипсином. Концентрации метанола: а — 0, б —
0,5 М; в— 1,0 М
7-6. Решается аналогично задаче 7-5.
Ответ; й2=0,98 сек-1; й3=0,21 сек-1; /(S=0,5M.
7-7. Решается аналогично задаче 7-5 (рис. 77). Ответ: /г,=6,4 сек-1; Ks= 1,8-10~2М; /гя»/г2.
7-8. Решается аналогично задаче 7-5.
Ответ: ?2=0,42 сек-1; ?3=1,17 сек-1; Ks—5,78- 10-3М.
7-9. Для вывода уравнения скорости образования продукта Р2
(схема 7.12) в присутствии дополнительного нуклеофильного аген-
та N запишем уравнение материального баланса по ферменту (7.26), выражение для константы диссоциации фермент-субстрат-ного комплекса (7.27) и условие стационарности концентрации ацилфермента (7.28) в ходе ферментативной реакции
[E]0=[E] + [ES] + [EA], (7.26)
ГУ И [S] /-7 07\
К s = —[ES] ’ (7'27)
= k2 [ES] - (k3 + k4 [N]) [EA] = 0. (7.28)
Комбинируя уравнения (7.26) — (7.28) с выражением
^- = Й3[ЕА|, (7.29)
получаем уравнение скорости ферментативной реакции
dP2 k2 + k3 + MN] tE]o[S]°
dt „ k3 + fet [N]
s ft, + *, + MN] +[S]o
(7.30)
Из уравнения (7.30) видно, что зависимость максимальной скорости образования продукта Р2 (при [S] о^Кщиаш)) от концентрации добавленного нуклеофильного агента определяется выражением
^m ____ _____________________________________k2k3_ /7 on
[Е]0 “ А, + й. + *«[N] ’ ' ' ;
Линеаризуя выражение (7.31) в координатах ([Е]0/Vm, [N]) и учитывая, что для изучаемой реакции kzjk3=2,5, находим значения индивидуальных констант скоростей ферментативного сольволиза. Ответ: ?2=0,С65 сек-1; k3=0,266 сек-1; ?4=2,04 М-1-сек-1.
7-10. Из уравнения (7.30) находим
1 _ J_ . J_ 4- MN]
и I h I и и *
^кат ^2 _ _
Кщ (каж) __ Ks _|_ Ksk* tN]
АКат A2 А2/?з
Рассматривая полученные выражения, видим, что линеаризация кинетических параметров ферментативной реакции в координатах (1/&кат, [N]) и (Лт(каш)/&кат, [N]) позволяет провести раздельное определение значений k2, k3, k4 и Ks (рис. 78).
Ответ: k2 — 55,8 сек-1; ?3=9,30 сек-1; &4=12,8 М_1-сек '; Ks = = 0,1 М.
Рис. 78. Определение индивидуальных констант гидролиза и метанолиза метилового эфира Ы-ацетил-Ь-норвалина под действием а-химотрипсина
7-11. Из рис. 79 видно, что отношение скорости гидроксиламино-лиза к скорости гидролиза одинаково для амида, метилового эфира и n-нитрофенилового эфира глутарсвой кислоты, что свидетельствует в пользу существования общею ацилферментного промежуточного соединения для всех изученных субстратов (схема 12).
7-12. Для вывода уравнения скорости образования продукта Pi (см. схему 7.12) в присутствии дополнительного нуклеофильного агента выражения (7.26) — (7.28) комбинируют с выражением
dPl k2 [ES], (7.32)
dt
получая в итоге уравнение
М^з + ЫМ]) Г1 „ k2 \ k3 + Л* [N]
d\\ ' dt
k3 + k4 [N]
*s 1ГР*.-: MNP + ^
(7.33)
Из полученного уравнения видно, что если ацилирование (йг-С&з) лимитирует скорость ферментативной реакции, величина ^кат не должна зависеть от [N]. В случае &2>&з+&4 [N] величина ^кат линейно зависит от [N]. Наконец, при соизмеримых значениях k2 и k3 величина йкат не должна являться линейной функцией от концентрации добавленного нуклеофильного агента.
