Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
3,0 3,37 3,23 3,30
7-12. Реакция гидролиза амида глутаровой кислоты, катализируемого ш-амидазой, проходит по трехстадийному механизму [8]. Исходя из данных табл. 12, определить, какая из двух стадий — ацилирование или деацилирование — лимитирует скорость фермен* тативной реакции, если кинетика гидролиза глутарамата регистра ровалась по выделению аммиака (продукт Р| на схеме 7.12).
Влияние гидроксиламина на каталитическую константу превращения глутарамата, катализируемого ю-амидазой. Условия опыта: pH 7,0; 30° С; 0,05М фосфатный буфер; [Е]0 = 2,8-10 2 мг/мл
[NH2OH|-103, м ftKaT*I06, моль/мин-ыг белка
0 5,55
2,0 7,15
4,0 9,10
8.0 12,50
7-13. При конкурентном гидролизе и этанолизе л-нитрофенил-гиппурата под действием папаина конечными продуктами реакции являются гиппурозая кислота и этилгиппурат [9]. Исходя из соотношения между концентрациями этих продуктов в реакционной смеси (табл. 13), вычислить отношение констант скоростей этано-лиза и гидролиза kjk^.
Таблица 13
Зависимость концентрации гиппуровой кислоты (ГК) в реакционной смеси от концентрации этанола после окончания сольволиза /г-нитрофенилгиппурата, катализируемого папаином. Условия опыта: pH 6,0; 40° С;
0,3M КС1; 1,ЗМ ацетоиитрила; [Е]0 = 5,7-10~7М
1С2Н5ОН], м [ГК]-10*. м
0 3.58
0,86 2,87
1,72 2,49
2,58 2,29
7-14. Кинетику гидролиза л-нитрофенилфосфата, катализируемого щелочной фосфатазой, изучали по образованию «-нитрофенола и фосфат-иона (продукты Pi и Р2 схемы 7.1 соответственно). Было найдено, что при проведении ферментативной реакции в 1М трис-буфере (1М водный раствор трис-оксиметил-3-аминометана) отношение концентраций продуктов Pi/P2 в процессе реакции равнялось 2,1 Исходя из предположения, что трис-буфер принимает участие в ферментативной реакции в качестве дополнительного нуклеофильного агента [10], определить отношение констант й4//г3 (см. схему 7.12).
7-15. Краситель эриохром черный Т является неполным неконкурентным ингибитором гидролиза этилового эфира Ы-ацетил-Ь-ти-розина, катализируемого а-химотрипсином (Кт(кат)—7,58-10~4 М
для всех концентраций ингибитора в интервале [I] =0—1,35Х Х10-4 М). Исходя из данных табл. 14, определить возможные кинетические и равновесные параметры схемы (7.18), если известно, что для исследуемой реакции выполняемся соотношение
Т а б л и ц а
14
Влияние эриохрома черного Т на каталитическую константу гидролиза этилового эфира N-ацети л-L-ти розина, катализируемого а-химотринсином.
Условия опыта: pH 7,0; 25° С; ионная сила 0,1М (КС1); [Е]0 = 4 !0-8 М
[I]0-l°s, М *кат- сек~1
0 135,0
1,0 92,5
2,0 80,0
2,4 71,2
3,0 68,7
5,0 60,0
7,0 58,8
13,5 55,0
и константа димеризации красителя, определенная из независимого эксперимента, равна 2,5-10-4 М (димер красителя не ингибирует ферментативную реакцию)
Е + S
IE + S
*->- Е + Р,
IE + Р2
(7.18)
7-16. При взаимодействии а-химотрипсина с Ы-ацетил-Ь-трии-тофаном происходит быстрое образование равновесного комплекса фермент кислота, за которым следует реакция ацилирования фермента сзободной кислотой [11]. При низких значениях pH ([Н ] ~>Ка, где Ка —константа диссоциации Ы-ацетил-Ь-триптофа-на) кинетическую схему этой реакции можно записать в виде
«р "з
Е + Р 1" ЕР П=2 ЕА + Н20,
*•>
(7.19)
где Р — протониров'анная форма Ы-ацетил-Ь-триптофана, КР — константа диссоциации комплекса фермента со свободной кислотой (ЕР).
1) Исходя из данных табл. 15,-найти константу скорости ацили-роваиия фермента свободной кислотой (k-3), если из независимых экспериментов были найдены значения й3=10-2 сек-1 и Кр — = 3-10-3 М.
Таблица 15
Кинетика установления равновесия при взаимодействии а-химотрипсина с 1М-ацетил-Ь-триптофаном. Условия опыта: pH 2,3 (цитратный буфер); 25е С; ионная сила 0,0Ш; [Р|0 = 5,94-10 “6М. Концентрация свободного фермента определялась титрозанием его /г-нитрофениловым эфиром М-ацетил-Ь-триптофана
Время, сек Концентрация свободного
фермента. %
0 100
10 91,6
20 74,7
30 59,9
40 44,3
