Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
8-14. Указать, как должен быть поставлен кинетический эксперимент, чтобы была возможна линеаризация экспериментальных
данных в координатах ^[Р]Д, 1 It In ^ ^р]~) в случае заметной
денатурации фермента в ходе реакции. Принять, что связывание субстрата с ферментом не влияет "на скорость инактивации последнего.
8-15. Кинетические параметры гидролиза бензилпенициллина до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) под действием иммобилизованной пенициллинамидазы при 40° С равны йнат=15 сек"1, К,.(каж)=3,1 • 10“6 М. Константа инактивации пенициллинамидазы в условиях проведения реакции равна 10-5 сек-1, причем связывание с ферментом субстрата или продуктов реакции не влияет на скорость инактивации фермента. Рассчитать, -какое количество 6-АПК (мол. вес 217) можно получить с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы в периодически действующем реакторе объемом 100 л (начальная концентрация активного фермента равна 3-10~6М, начальная концентрация субстрата равна 1,0М), если степень конверсии субстрата в каждом реакционном цикле должна составлять 99%. В расчетах учесть, что константа конкурентного ингибирования пенициллинамидазы вторым продуктом реакции, фенилуксусной кислотой, равна 2,8-10~5 М.
8-16. Определить константу скорости инактивации фермента, вызываемой субстратом (см. схему 8.23), если фермент инактивируется практически полностью при прохождении реакции превращения субстрата на 20%. Начальная концентрация фермента равна 2-10~5М, начальная концентрация субстрата равна 0,8 М, йкат=0,2 сек-1
(каж) It
Е+ S ;=TES—Е + Р (8.23)
Неактивный фермент
8-17. В реакции гидролиза нитрокатехолсульфата, катализируемого арилсульфатазой А, фермент инактивируется под действием субстрата согласно схеме
Е + S Г— ES -------- Е + Р (8.24)
Неактивный фермент
где а<С 1 [Й] ¦ Исходя из данных табл. 9, найти значения k2 и а, если эксперимент проводился при условиях [S] ^Ks-
Таблица 9
Кинетика накопления пирокатехола в реакции гидролиза нитрокатехолсульфата, катализируемого арилсульфатазой А.
Условия опыта: pH 5,3 ; 37° С; 0,03М формиата натрия; [Е]0 = 1,25-10_3 мг/мл; [S]0 = 5-10_3M
Время, мин [Р]-10=, м
0,5 0,67
1,0 1,14
2,0 1,79
2,5 2,08
5,0 2,77
10,0 3,12
20,0 3,70
Ответы и решения
8-1. Преобразуя интегральную форму уравнения Михаэлиса
[Р] ~Vmt- Кш (ка*) In (8.25)
и обозначая тангенс угла наклона прямой через а, отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат, через Ь, и отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, через с, получаем
[Р] __ 1/ Кт (каж) |[S]p
’ t t [S]„ — [P] ’
= Km (каж), Ь = VС = I/т/Km (каж) !
^ ^ I Кт (каж) 1 i_ [S]0
;[Р] Vm 'Vm ' [Р] [S]„-[P]’
а _ Krnl'каж) ^ b=\jVm, С = — 1//Ст(каж) !
t Кт (каж) р [Р]
ГЧ1. ~ 1/ “Г
, Vm ^ . [S]. ’
1п [S]„[P] Kmln[S]0-[P]
a = llVm, Ь = , С = Кт (каж)-
v т
8-2.^0писанный в задаче эксперимент — один из вариантов интегрального анализа кинетики ферментативных реакций. Однако в отличие от классического метида, в котором при данной началь-
ной концентрации субстрата определяется текущая концентрация продукта, в данном случае варьируется начальная концентрация субстрата при постоянной величине t в уравнении (8.25). Тгким образом, для линеаризации экспериментальных данных можно применять все виды интегрального уравнения Михаэлиса—Ментен см. например (рис. 83).
Ответ: ?кат=0,038 сек-1; Кт(каж)=3,1 • 10~2 М.
ь
^1п Д^- .70^сек' t [5Jo[P]
Рис. 83. Определение кинетических параметров гидролиза амида М-ацетил-Ь-гек-сагидрофенилаланина, катализируемого а-химотрипсином, с помощью интегральной формы уравнения Михаэлиса
Рис. 84. Определение кинетических
параметров гидролиза метилового эфира 1Ч-ацетил-1.-фенил а ланил-L-лизина, катализируемого трипсином, в присутствии конкурентного ингибитора, 1-метил-2-аминоиндола. а [I] =0, Д =1-50 сек; б [I] = 1,46-Ю~3 М,
А =180 сек; в [I] = 1,84-10~3 М,
А= 195 сек; г [I] = 3,25-10~3 М.
Д = 210 сек
8-3/Для обработки данных табл. 2 удобно использовать коор-
динаты типа [ Di — Dh in
Dr
¦D_
D',
где применительно к этой
таблице (Di—Dt) - разница концентраций субстрата, выраженная в см диаграммного лйста через равные интервалы времени (А), ('Do, — Dt) и (Z)oo — D'i) — концентрации непрореагировавшего суб-
/,и 4,и 6,0
