Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Ио
[E] + [ES] + [EI] [Е] [S]
[EL
2J>
К s К,= *1 =
[ES] [Е] [I] [EI] ’ [El] [1] [Е12] '
(6.74)
(6.75)
(6.76)
(6.77)
Комбинируя выражения (6.74) — (6.77) с выражением для скорости распада фермент-субстратного комплекса
v
k2 [ES],
найдем уравнение скорости ферментативной реакции
^2 [Е]0 [S]o
V
К,
где
К
т (каж) :
К.
т{ каж)
+ [S]„
Ki
+
[I]2
Ki К,
(6.78)
(6.79)
Преобразуя выражение (6.79), получим
К
т (каж)
К s
[I]
кГ +
[П
KiKi
/ (каж) j \
Откладывая данные табл. 18 в координатах (------------------- , [I]/ ,
получаем прямолинейную зависимость (рис. 69). Таким образом, схема (6.73) описывает результаты эксперимента с константами ингибирования /Ci=2,2-10-5 М; К'i= 1,2-10-4 М.
Ответ: й2= 193 сек-1; A"s = 6,63 -10—4 М; /Ci=2,2-10-5 М; K'i = = 1,2 • 10-4 М.
Рис 69. Определение констант ингибирования ферментативной реакции в случае связывания с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора
[I]
Рис. 70. Графический вариант определения констант ингибирования ферментативной реакции в случае связывания с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора (уравнение 6.80)
Примечание. Анализ кинетики ферментативной реакции, в которой с активным центром фермента могут связываться две молекулы конкурентного ингибитора, можно провести также следующим образом. Из уравнений (6.78) — (6.79) можно легко получить выражение
j_______L = Ks ( гс _i_ гсг \
vl v Vm [S]o \К 1 KiK'i I
и далее
______i______________/1 _l _Ш_\ (6 80)
[I] Ui « / j SK,Km[S]0^ 1 (0-GU)
В случае справедливости схемы (6.73) обработка экспериментальных данных в координатах (1/[I] (1 /и4—l/v), [I]) должна приводить к пучку прямых, соответствующих различным начальным концентрациям субстрата, пересекающихся на оси абсцисс в точке— К'I и имеющих ташенс угла наклона, равный /Cs/KiVm[S]o (рис. 70).
Рис. 71. Графический вариант определения констант ингибирования ферментативной реакции в случае связывания с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора (уравнение 6.81)
й0/;ио4.м
Рис. 72. Определение абсолютной концентрации фермента из кинетических данных при условии [E]o~[S]o
где X = —----. Из абсциссы точки пересечения и тангенса угла
* т
наклона полученной прямой (рис. 72) найдем значения k2, Кs и [Е]с.
Ответ-. [Е]0 = 3,6- 1СМ М; tfs = 6,2-10-4M; /г2=1,14х
X 10-2 сек-1.
ЛИТЕРАТУРА
1. БресткинА. П, Новикова Н. В., Прокофьева Е. Г., Ржехи-
на Н. И. „Биохимия", 26, 266, 1961.
2. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М., „Мир“, 1966, стр. 80.
3. Fuller R. W., Marsh М. М. „J. Med. Chem.“, 15, 1068, 1972.
4. Rosenberry Т. L., Bernhard S. A. „Biochemistry" 11, 4308, 1972.
5. Nakata H„ Yoshida N„ Narahashi Y. Ishii S. „J. Biochem.-, 71,
1085, 1972.
JSVJ_________= _ШЛ (6.81)
[qUi v ) KxVm ' ’
анализ которого в координатах ----, [I]) приводит к
единственной прямой (рис. 71), пересекающей ось абсцисс в точке
— Ки и ось ординат —в точке KstKxVm.
6-22. Используя соотношения
(6.22) и (6.24), проведем линеаризацию экспериментальных данных в координатах (1/1-(-Х, [S]0/X),
6. Hakala М. Т., 01 aid A. J., Schwert 0. W. „J. Biol. Chem.221,
191, 1956.
7. Wilson I. B., Bergmann F. ,,J. Biol. Chem.", 186, 683, 1950.
8. Marcus P. 1., Talalay P. „Proc. Roy Soc.“, Ы44, 116, 1955.
9. В u n t i n g J. W., Murphy J. „Biochem. Biophys. Res. Commun." 48, 1316,
1972.
10. L u m г у R., S m i t h E. L„ О I a n t z R. R. „J. Amer. Chem. Soc.“, 73, 4330,
1951.
11. Trowbrige C. G., Krehbiel A., Laskowski M. „Biochemistry",
2, 843, 1963.
12. Nakata H., Ishii S. — 1. „Biochem. Biophys. Res. Commun. 41, 393, 1970.
13. Hofstee В. H. J. „Biochim. Biophys. Acta*, 258, 446, 1972.
14. Bechet J. — J., Yon J. „Biochim. Biophys. Acta". 89, 117, 1964.
15. Seydoux F. „Eur. J. Biochem.“, 17, 209, 1970.
16. Inagami Т., Sturtevant J. M. „Biochemistry", 4, 1330, 1965.
17. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., „Мир", 1966, стр. 58.
18. Pocklington Т.. Jeffery J. „Biochem. J.“, 112, 331, 1969.
19. F е m f е г t U„ С i с h о с k 1 P. „FEBS Letters", 27, 219, 1972.
20. Katsumata M. „J. Theoret. Biol.", 24, 294, 1969.
Глава 7
СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ТРЕХСТАДИЙНЫХ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ КОНСТАНТ СКОРОСТЕЙ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СТАДИЙ
§ 1. Кинетическое описание трехстадийных ферментативных реакций
Большое число ферментативных реакций (в особенности реакций гидролитического типа) протекают по так называемому трехстадийному механизму
Ё + Я -—*¦ V. + Р3 (7.1)