Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Р,
где ЕА—ацилферментное промежуточное соединение, образованное в результате ацилирования активного центра фермента молекулой субстрата; Pi и Рг — продукты реакции, образованные на стадиях ацилирования и деацилирования соответственно; k2 и k3 — индивидуальные константы скоростей реакций ацилирования и деацилирования. Если фермент-субстратный комплекс ES находится в квазиравновесном состоянии с исходным субстратом и ферментом, то Ks называется истинной константой Михаэлиса. Определяемые на опыте параметры ферментативной реакции, каталитическая константа &Кат и кажущаяся константа Михаэлиса Кт(каж)
связаны со значениями индивидуальных констант схемы (7.1) соотношениями
Из уравнения (7.4) следует, что кинетика трехстадийных ферментативных реакций формально описывается классической двухстадийной схемой (7.5), и, следовательно, к ним применимы все основные методы кинетической обработки двухстадийных реакций, рассмотренные в гл. 5:
Довольно сложной проблемой в изучении кинетики трехстадийных ферментативных реакций является определение значений индивидуальных констант k2, k3 и Ks (схема 7.1). Как видно из уравнения (7.4), кинетический анализ трехстадийной реакции в стационарном режиме ее протекания не позволяет в общем случае раздельно определять значения индивидуальных констант. Однако в ряде случаев значения k2, k:i и Ks можно определить путем селективного воздействия каких-либо эффекторов на отдельные стадии (ацилирования или деацилирования) стационарной ферментативной реакции.
§ 2. Селективное влияние эффекторов (ингибиторов или активаторов) на стадию ацилирования
Если имеется возможность влиять на стадию ацилирования трехстадийной ферментативной реакции с помощью селективно действующего эффектора, то при этом эффективные кинетические параметры уравнения
^2^-3
(7.2)
кг + кг ’
(7.3)
входящими в простое уравнение Михаэлиса — Ментен
__ ^кат [Е]0 [Sj0
(7.4)
Кщ (каж) [S]o
т (каж) д,
Е + S1-----------ES —Е + Р.
К т (каж)
(7.5)
^(Ka«) + [S]o
<ат И. IS].
Г* ГО!
(7.6)
будут определяться выражениями
(7.8)
(7.7)
где индекс (*) указывает на величину, измененную в присутствии эффектора. Решая совместно уравнения (7.4) и (7.6), нетрудно показать, что в координатах Лайнуивера-Берка семейство прямых (\/v, 1/[S]о), полученных при различных концентрациях эффектора, пересекаются в общей точке, расположенной в левом верхнем квадранте, с координатами
« ME]»' * v
Определив таким образом значения индивидуальных констант и Ks, легко найти значение /г2 из соотношения
Следует отметить, что положение точки пересечения в данной координатной системе не зависит от характера функциональной зависимости константы &2 от концентрации эффектора. Таким образом, применение ингибитора или активатора, избирательно влияющего на скорость стадии ацилирования, позволяет проводить раздельное определение индивидуальных констант k2, k3 и Ks независимо от конкретного механизма действия эффектора.
§ 3. Влияние дополнительных нуклеофильных агентов на стадию деацилирования
В случае гидролитических ферментативных реакций, протекающих по трехстадийному механизму, нуклеофильные агенты, добавленные в реакционную систему, могут конкурировать с водой на стадии деацилирования ацилфермента
где N — дополнительный нуклеофильный агент; Р3 — продукт реакции переноса ацильной части субстрата на нуклеофил, происходящей с константой скорости второго порядка &4; k3— k'3 [Н20]. Кинетический анализ схемы (7.12) для реакции, протекающей в стационарном режиме, приводит к уравнению скорости (7.4), где
к.
Т,
(7.11)
(7.12)
кг + К [N]
(7.13)
к%-] кг -\- A4[N]
И
k2 (k, К [N]) кат = k, ?3+A4[N]
при регистрации продукта Р[5
h —
п'кат
при регистрации продукта Р2 и
ккят k2 + kz + К [N] 15^
ь__________k'lki _____ (7 16>
k, + kl + ki[N] к ;
при регистрации продукта Рз [1]. Если кинетика реакции (7.12) регистрируется по выделению кислоты Р2, то, как можно показать совместным решением двух уравнений (7.4) с учетом соотношений
(7.2) — (7.3) и (7.13), (7.15), в координатах Лайнуивера-Берка семейство прямых (l/v, 1 /[S]о), соответствующих различным концентрациям [N], пересекаются в общей точке, расположенной в верхнем левом квадранте, с координатами (7.9) и (7.10), откуда можно определить значения индивидуальных констант k2, k3 и Ks
