Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
где Vnl = k2[E\0. При высоких концентрациях субстрата, при которых выполняется неравенство kY |^1 + ^-°j > уравнение (6.70)
упрощается до обычного уравнения Михаэлиса — Ментен
Ут [S],
Ks + И» ’
линеаризируя которое в подходящих координатах (см. гл. 5) можно найти значения Vт и Ks (рис. 65). В области низких концентраций субстрата ([S]0<^ Ks) скорость ферментативной реакции должна линейно зависеть от [S]0:
или
kl~\~ ?_х
Л-.
Ks
K,
Ут [S]„
(6.71)
Из выражения (6.71) видно, что график в координатах (I/o, I/[S] о) позволяет найти значение константы обратимой изомеризации фермента k-\jk\ (рис. 66).
Ответ: Vm= 1,64-10-4 М; Ks=7,5-10-4 М; /Сравн=й1/й_1 = 4,6.
0,3 ? 6,0
X
со 40
¦w о
0,2
' сГ е гГ
^ °>1 1 - 1 t -1----1--- ь 2.0
-0,01 0 0,01 0,D2 DJ03 0,04 0 05
Рис. 65. Определение кинетических параметров гидролиза и-нитроанили-да L-аланина, катализируемого ами-нопептидазой М
7Ио (
Рис. 66. Обработка кинетических данных, соответствующих невысоким концентрациям субстрата, при обратимой изомеризации фермента, которая приводит к образованию неактивного конформера
6-20. Схема превращения одного субстрата, катализируемого двумя различными ферментами, может быть представлена в следующем виде:
Ej + S
e2 + s
/>(1)
ктп{ каж)
к(1)
А кат
*<2)
Кт(каж)
EjS^Ej + P,
А-(?)
+ Е? кат
*е2+р.
Общая скорость реакции в этом случае должна быть равна сумме скоростей обеих ферментативных реакций
V.
общ
=Г г,1 + г,2.
причем для рассматриваемого случая скорость гидролиза, катализируемого трипсином, должна являться максимальной (так как
[S]о^Кпцкаж) для катализа трипсином). Отсюда суммарная скорость ферментативной реакции может быть записана в виде
*ica\[E]o[S]e , /с vox
>|Ц ^ ТАГ)-----[Т]о- (6.72)
/чт (каж) "Г L°Jo
где [Е] о — концентрация промышленного препарата а-химотрип-сина в растворе; [Т]0 — концентрация трипсина, присутствующего в виде примеси в препарате а-химотрипсина. Из выражения (6.72)
-1Р 0 2,0 4,0 6,0
VLsyc.V
Рис. 67. Определение количества трипсина в препарате а-химотрип-сина с помощью специфического субстрата трипсина — этилового эфира М-бензоил-Ь-аргинина: а — результаты эксперимента; бив — значения скоростей ферментативной реакции рассчитаны в предположении, что в препарате а-хи-мотрипсина содержится 0,075 и 0,2% трипсина соответственно
Рис. 68. Влияние концентрации ингибитора на величину кажущей ся константы Михаэлиса ферментативной реакции в случае связывания с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора
очевидно, что зависимость в координатах (1/у0бщ, 1 / [S] о) не должна в общем случае быть линейной, что и наблюдается на опыте (рис. 67). Для нахождения величины [Т]0 выражение (6.72) можно записать в виде
V,
общ
- то ¦
V, -
*141 [Е]о [S]B ^!ож) + IS].
и, произвольно варьируя возможное содержание трипсина в препарате а-химотрипсина, откладывать полученные значения в координатах (l/v\, 1/[S]о)- Для рассматриваемого случая кривая линеаризуется в предположении, что исходный препарат а-химотрипсина содержит 0,075% активного трипсина (см. рис. 67).
6-21. Обработкой данных табл. 18 в координатах Лайнуивера-Берка можно показать, что профлавин является конкурентным ингибитором а-химотрипсина. Однако зависимость в координатах ( ^(т(каж)< Ш) в данном случае является нелинейной (рис. 68), в отличие от простого конкурентного типа ингибирования. Одной из возможных причин подобной зависимости может быть связывание с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора:
E + S^ES^E + P (6.73)
EI
*il
I
EI,
Для вывода уравнения скорости этой ферментативной реакции запишем уравнение материального баланса по ферменту и выражения для констант диссоциации фермент-субстратного и фер-мент-ингибиторно.'о комплексов:
