Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые
разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их
обратимую денатурацию: концентрированные растворы мочевины и
гуанидинхлорида, экстремальные значения pH и т. п.
135
Если образование агрегатов сопровождалось ковалентным сшиванием отдельных
глобул между собой S-S-связями, то эти связи необходимо разрушить. Это
достигается при действии относительно невысоких концентраций (порядка
мкмоль/л) тиол-содержащих реагентов: цистеина или дитиотреитола; в этих
условиях, как правило, не затрагиваются внутримолекулярные S-S-связи в
белке. Если при образовании ковалентных агрегатов большую роль сыграли и
нековалентные взаимодействия, то действие тиолов дополняется высокими
концентрациями денату-рантов типа мочевины.
Реактивация белков с измененной первичной структурой. Если белок потерял
активность в результате химической модификации функциональных групп, то
можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической
реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например,
их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток
низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.
Если под действием тиола в белке были разрушены S-S-связи, что привело к
его инактивации, а образовавшиеся SH-группы провзаимодействовали с
получением смешанных с тиолом дисульфидов, то такие ферменты иногда можно
реактивировать, добавляя другие тиолы или ионы металлов. Механизм
реактивации заключается в расщеплении смешанного дисульфида и последующем
образовании "правильной" S-S-связи.
В литературе пока практически отсутствуют примеры удачной реактивации
белков, инактивация которых явилась следствием таких химических
процессов, как гидролиз пептидных связей, фосфорилирование,
дезамидирование остатков аспарагина.
Десорбция инактивированного белка со стенок реакционного сосуда. Как уже
отмечалось, "сорбционная инактивация" бёл-ков обусловлена слабыми
нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными,
водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки.
Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических
взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием
концентрированных растворов мочевины или гуанидин-хлорида и других
реагентов, являющихся "обратимыми денату-рантами" для большинства белков.
Реактивация "необратимо денатурированных" ферментов. Реактивацию удается
провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой (рис. 25):
сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе
ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в
развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в
нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации
какого-либо "необратимо денатурированного" фер-
136
Рис. 25. Схематическое изображение цикла: термоинактивация - реактивация
фермента; а - разворачивание термоинактивированного фермента с
одновременным расщеплением S-S-связей; б - последующее сворачивание
фермента в каталитически активную конформацию, сопровождающееся
реокислением S-S-связей
мента, по существу, сводится к решению двух задач. Во-первых, поиску
условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для
разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты,
с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в
состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы
обратимых денатурантов (мочевины или гуанидинхлорида); если в белке
имеются S-S-связи, то действие денатурантов усиливают добавлением тиолов
- реагентов, расщепляющих S-S-связи. Во-вторых, экспериментальному
подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в
нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто
полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты,
ингибиторы, кофакторы и т. п.), которые одновременно являются и
эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.
К настоящему времени, основываясь на описанной двухстадийной процедуре,
удалось реактивировать около десятка различных ферментов. По-видимому,
число примеров удачной реактивации "необратимо денатурированных"
ферментов будет увеличиваться по мере накопления знаний об особенностях
процессов денатурации и ренатурации (разворачивания и сворачивания)
белков.
Возможность реактивации ферментов, инактивированных по другим, более
сложным механизмам. В гл. 5 было отмечено, что такие процессы в белках,
как диссоциация кофактора из
137
активного центра фермента, диссоциация олигомерного белка на субъединицы,
в принципе ..являются обратимыми. Иными словами, эти процессы сами по
себе не приводят к необратимому характеру инактивации, а лишь "запускают"
другие, истинно необратимые процессы: агрегацию, ковалентные изменения в
структуре белка, "необратимые" конформационные изменения. Таким образом,
