Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Следует также отметить, что иногда в литературе обсуждается механизм
внутримолекулярного перераспределения S-S-связей. Его можно представить
следующим образом: под действием гидроксид-ионов в белке расщепляются
некоторые "нативные" S-S-связи и образуются SH-группы. Они, в свою
очередь, могут атаковать другие^-S-связи в молекуле белка, что должно
приводить к образованию новых "ненативных" дисульфидных мостиков. Однако
этот гипотетический инактивационный механизм представляется маловероятным
и до сих пор не нашел экспериментальных подтверждений.
Химическая модификация участвующих в катализе SH-epynn. в ферментах
(например, входящих в состав активных центров). Подобная модификация
часто приводит к инактивации ферментов. Один из примеров такой
модификации - высокотемпературное окисление SH-групп был рассмотрен выше.
В качестве другого примера можно привести "отравление" белков катионами
тяжелых металлов: Hg, Pb, Си и другими, следовые качества которых всегда
присутствуют в воде. Механизм такой инактивации состоит в модификации SH-
групп белков, проходящей до образования соответствующих меркаптидов.
123
Фосфорилирование белков in vivo. Этот процесс играет важную регуляторную
роль и иногда вызывает инактивацию ферментов. Происходящие при этом
молекулярные процессы до конца не ясны. По-видимому, в большинстве
случаев потеря ферментом активности вызвана не непосредственно
ковалентным ввс дением в белок фосфатных групп (через остатки серина,
треонина, тирозина), а происходящими вслед за этим конформационными
изменениями. С этим механизмом инактивации также приходится считаться in
vitro, поскольку фосфорилазы и фосфатазы (ферменты, осуществляющие
фосфорилирование) иногда содержатся в препаратах белков в качестве
примесей.
"Самоубийственная" (суицидная) инактивация. Так принято называть группу
механизмов, при которых в ходе каталитического акта ферментативной
реакции образуется реакционноспособная частица (чаще всего
свободнорадикальной природы), способная химически модифицировать
функциональную группу активного центра и тем самым нарушать активность
фермента. В качестве примера приведем инактивацию простагландинсин-тетазы
свободным радикалом пероксидной природы, образующимся из арахидоновой
кислоты под действием самого же фермента. Механизм "самоубийственной"
инактивации обнаружен для ферментов различных классов (гидролаз,
оксидоредуктаз). In vivo, по-видимому, он играет важную регуляторную
роль, контролируя в клетке содержание некоторых "ключевых" ферментов,
обладающих особенно высокой каталитической активностью. Однако при
практическом использовании ферментов для синтеза или_ модификации
физиологически важных соединений с такой инактивацией необходимо
бороться.
Радиационная инактивация ферментов (под действием рентгеновского и у
излучения, УФ света и т. п.) является сложным многостадийным процессом. В
нем выделяют фотофизические, фотохимические стадии (химические реакции
под действием облучения в хромофорах- триптофане, цистеине и др.), а
также темновые химические реакции. Возможность радиационной инактивации
необходимо учитывать в тех случаях, когда иммобилизация ферментов
(например, при образовании гелей) инициируется у излучением, УФ светом и
др.
Рацемизация аминокислот в белках. Этот процесс проходит в "сверхжестких"
условиях - при экстремальных значениях pH (ниже 2,0 и выше 12,0) и
температуре выше 100°С. Поскольку в настоящее время в таких условиях
ферменты не применяют, то далее этот инактивационный механизм
рассматриваться не будет.
Дезаминирование остатков аспарагина. Этот процесс происходит в белках с
заметными скоростями при высоких температурах (порядка 100°С) и
слабокислых значениях pH (порядка 4,0-5,0). Такое изменение первичной
структуры ферментов также приводит к их инактивации.
Десорбция кофактора из активного центра фермента. Известен большой класс
ферментов, в состав активных центров
124
которых входят атомы металлов, металлосерные кластеры и другие
нековалентнсГ связанныёЗпрЪстетичёСКгё 'Зрушщ^ДкофакТст' ры). HpIT
нагрейТнийТ^цеиствии некоторвпГхимических реагентов (например,
хелатирующих), равновесном диализе и других процедурах равновесие между
связанной с белком и свободной, несвязанной формами кофакторов может
сдвигаться в сторону последней и кофакторы диссоциируют из активных
центров ферментов в раствор. Если удаление кофактора из активного центра
не сопровождалось последующими значительными изменениями конформации
белка, то при добавлении избытка кофактора к денатурированному ферменту
он самопроизвольно реактивируется. Однако если диссоциация кофактора
привела к большим конфор-мационным изменениям или вслед за ней произошла
химическая модификация существенных для структуры функциональных групп,
то инактивация фермента становится необратимой.
Диссоциация олигомерных белков на субъединицы. При действии многих
денатурантов (мочевины, детергентов, кислот, нагревании и т. п.) на
