Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
ковалентные S-S-связи, так и нековалентные "солевые мостики", ионы Са2+ и
других металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.
Успех или неудача при попытке повысить стабильность фермента обработкой
бифункциональными реагентами в основном определяется соответствием длины
реагента расстоянию между возможными центрами пришивки на белковой
глобуле. Очевидно, что для каждого конкретного белка существует
оптимальный размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь
определения размера подходящего реагента - эмпирический поиск. Для этого
изучаемый фермент модифицируют соединениями гомологического ряда
бифункциональных реагентов, например алифатических диаминов или
имидоэфиров алифатических ди-карбоновых кислот, в условиях, когда не
происходит межмоле-кулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают
зависимость стабилизационного эффекта от длины бифункционального
реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с максимумом. Дело в
том, что при модификации бифункциональным реагентом наряду с образованием
"сшивок" происходит одноточечная модификация функциональных групп белка.
Соотношение этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции
сшивания, чем больше на поверхности белковой глобулы пар функциональных
групп, расстояние между которыми примерно равно длине сшивающего агента.
Именно в этом случае наблюдаются максимальные стабилизационные эффекты.
Следует отметить, что эмпирический характер поиска оптимального
сшивающего агента несколько снижает ценность метода внутримолекулярного
сшивания белков для практических целей. Действительно, для каждого вновь
взятого белка или при использовании нового гомологического ряда
бифункциональных реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента
надо проводить заново.
Тем не менее метод сшивок весьма полезен, поскольку позволяет получать
водорастворимые стабилизированные производные ферментов с относительно
низкой молекулярной массой (сравнимой с молекулярной массой самого
фермента). Такие препараты предпочтительны в некоторых прикладных
областях, в частности в медицине.
Механическое включение ферментов в "тесные" поры носите-
131
ля (рис. 24,в). Разворачиванию белковой глобулы можно также
воспрепятствовать, если поместить молекулу фермента в ячейку носителя, не
взаимодействующую с ней ни химически, ни сорб-ционно, но столь "тесную",
чтобы развернутая конформация не могла образоваться по стерическим
причинам. В этом случае нативная конформация белка могла бы
поддерживаться чисто механическим путем.
Стабилизацию фермента в "тесных" ячейках методически проще всего
осуществить включением белков в полимерные гели, например при проведении
процесса полимеризации мономеров в присутствии фермента. Известно (см.
гл. 1), что поперечно сшитые полимерные гели (полиакриламидный,
полисахаридные и др.) имеют пористую структуру. В геле, как правило,
наблюдается относительно узкое распределение пор по размерам; размер пор
задается концентрацией полимерных цепей. Он тем меньше, чем выше
концентрация полимера в геле. Поэтому, включая фермент в гели различной
концентрации, можно реализовать ситуацию, когда белковая глобула окажется
"зажатой" полимерными цепями носителя и благодаря этому "клеточному
эффекту" не сможет развернуться. В таких случаях достигаются существенные
стабилизационные эффекты: включенные в гель ферменты в тысячи раз
стабильнее своих нативных (неиммобилизованных) предшественников, причем
стабилизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация полимера.
Практическое применение гелевых препаратов тормозится, однако, тем, что в
водных растворах гидрофильные гели сильно набухают. При этом значительно
уменьшается концентрация полимера в гелевой фазе и, следовательно,
нарушается соответствие размеров пор геля и белковой глобулы. Один из
способов устранения этого нежелательного эффекта заключается в том, что
при получении гелей увеличивают концентрацию сшивающего агента; за счет
этого макроструктура образовавшихся гелей получается более жесткой и они
набухают в гораздо меньшей степени.
§ 5. Пути стабилизации ферментов, не основанные на методе иммобилизации
Стабильные препараты иммобилизованных ферментов можно получать не только
методами иммобилизации, но и другими путями. Иммобилизации подвергают
ферменты, которые сами по себе обладают высокой стабильностью. Это прежде
всего высокостабильные биокатализаторы, встречающиеся в природе. Для
этого проводят поиск ферментов, обладающих высокой термостабильностью,
как в мезофильных организмах, живущих при обычных температурах, так и в
термофильных микроорганизмах, которые самой природой приспособлены для
существования в высокотемпературном режиме. Кроме того, стабильные
132
ферментные препараты можно создавать искусственным путем, например
методами химической модификации и белковой инженерии.
Химическая модификация белков. Со времени появления первых сообщений об
изменении стабильности ферментов в результате модификации их
