Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
продолжительность не превышает 10-15 мин. Затем препарат помещают в 10 мл
0,1 М раствора трисового буфера (pH 8,0), содержащего 10 мг ЭДТА и смесь
глутатионов: 12 мг восстановленной формы и 2,4 мг окисленной формы.
Инкубацию иммобилизованного препарата в этих условиях проводят
149
в течение 1-2 сут при 20°С. При этом происходит реактивация
иммобилизованного трипсина на 70-100% от уровня исходной (до
иммобилизации) активности фермента.
6. Микрокапсулирование ферментов в полупроницаемые нейлоновые оболочки
методом межфазной полимеризации. К 0,75 мл 10%-ного раствора
полиэтиленимина, pH которого доведен до 9,8, добавляют 0,75 мл 0,38 М
раствора 1,6-гексаметилендиамина в 0,8 М карбонатном буфере, pH 9,8.
Раствор перемешивают, охлаждают до 0°С, растворяют в нем 15 мг а-
химотрипсина. К полученному 1%-ному водному раствору фермента в
тефлоновом стаканчике объемом 100 мл, помещенном в ледяную баню,
добавляют 7,5 мл охлажденной смеси хлороформа и циклогекса-на (1 : 5 по
объему), содержащей 1% по объему эмульгирующего агента Спан-85.
Эмульгируют водный раствор фермента в органическом растворителе на
магнитной мешалке при 0°С в течение 1 мин. Размер капсул определяется
скоростью перемешивания и концентрацией Спан-85 - стабилизатора эмульсии.
К полученной эмульсии типа "вода в масле", не прекращая перемешивания,
добавляют 7,5 мл охлажденного 18 мМ раствора себацилхлорида в
вышеназванной смеси органических растворителей. Раствор себацилхлорида
готовят непосредственно перед употреблением путем растворения 0,03 мл
дихлорида в 7,5 мл смеси растворителей. В результате диффузии 1,6-
гексаметилендиамина из водной в органическую фазу на поверхности раздела
фаз образуется полимерная мембрана. Реакцию образования полимерной
мембраны на поверхности эмульсионных капелек проводят в течение 3-5 мин
при перемешивании. Для прекращения реакции полимеризации к суспензии
микрокапсул добавляют 15 мл вышеназванной смеси органических
растворителей.
Полученную суспензию микрокапсул разливают в две центрифужные пробирки и
добавляют в каждую по 10 мл 15%-ного раствора Спан-85 в смеси хлороформа
и циклогексана в объемном соотношении 1 :3. Суспензию перемешивают
палочкой и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1-2 мин, супернатант
удаляют.
Микрокапсулы диспергируют в 15 мл 50%-ного водного раствора Твин-20 на
магнитной мешалке в течение 1 мин при максимальной скорости
перемешивания. К полученной суспензии порциями добавляют 130 мл воды при
перемешивании на магнитной мешалке в 0,5 л стеклянном стакане (по мере
добавления воды постепенно снижают скорость перемешивания).
Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2- 3 мин. Супернатант
удаляют, микрокапсулы промывают раствором НС1, pH 3,0, до исчезновения
ферментативной активности в фильтратах. Полученные микрокапсулы хранят в
виде суспензии в 1 мМ НС1 при 4°С. Размеры полученных микрокапсул 10- 15
мкм.
7. Микрокапсулирование ферментов в поликарбонатные оболочки методом
двойного эмульгирования. К 10 мл 10%-ного
150
раствора поликарбоната в метилен хлориде при интенсивном перемешивании
быстро по каплям добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора фермента (pH
3,0), содержащего 5% полиэтилен-амина. Эмульгирование проводят в течение
1 мин. К полученной первичной эмульсии, не прекращая перемешивания,
постепенно приливают 50 мл 2%-ного раствора поливинилового спирта -
стабилизатора эмульсии в 0,5 М ацетатном буфере, pH 4,7. Продолжают
перемешивание в течение 2,5-3 ч при комнатной тем-, пературе. За это
время метилен хлорид полностью испаряется, и на поверхности водных
капелек фермента образуется твердая полупроницаемая полимерная оболочка.
Микрокапсулы отделяют и промывают 1 мМ раствором НС1 на воронке со
стеклянным пористым фильтром.
8. Солюбилизация ферментов в обращенные мицеллы поверхностно-активных
веществ в органических растворителях. К 2 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в
октане добавляют 5-150 мкл 10-50 мМ водного буферного раствора, pH 3-11
(концентрация не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы
следует использовать буферный раствор с более низкой концентрацией).
Смесь интенсивно встряхивают до образования оптически прозрачного
раствора. Для ускорения процесса образования прозрачного раствора,
содержащего большие количества буферного раствора, добавляют буферный
раствор порциями по 2-3% (40-60 мкл). Далее добавляют 5-20 мкл водного
раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образования оптически
прозрачного раствора. Фермент можно вносить и в виде навески сухого
обессоленного порошка, однако время растворения фермента в этом случае в
системе обращенных мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%)
существенно увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении
водного раствора белка до десятков минут и даже часов при внесении сухого
белка). Для солюбилизации белка и определения активности включенного
фермента наиболее широко используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в
