Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
фермента или совместно иммобилизовать молекулы кофактора и фермента на
одном носителе в непосредственной близости друг от друга. С помощью таких
методических приемов становится возможным подавить такой инак-тивационный
механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермента.
Наиболее сложная задача - затормозить химические изменения в белке,
приводящие к инактивации. Однако и в этой области имеются положительные
примеры использования иммобилизации.
В тех случаях, когда инактивация происходит под действием пероксида
водорода или супероксидных радикалов, хорошо зарекомендовал себя
следующий прием. Подвергающийся инактивации белок иммобилизуют совместно
с каталазой или супероксид-дисмутазой - ферментами, катализирующими
разложение, соответственно, Н2О2 и
Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются вследствие
окисления кислородом воздуха высокореакционноспособных функциональных
групп их активного центра и в первую очередь SH-групп. Такую инактивацию
также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент
иммобилизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью
"высаливать" кислород. В результате фермент экранирован от контакта с
инактиватором и стабильность его по отношению к окислению становится
существенно выше, чем у неиммоби-лизованного.
Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество-
инактиватор. Например, многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые
для катализа, инактивируются в результате их "отравления" катионами
тяжелых металлов по механизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой
фермент с другим белком с высоким содержанием реакциониоспособных SH-
групп или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные тиолы, добиваются
того, что основная часть катионов металлов расходуется не на "отравление"
фермента, а на модификацию SH-групп "несущественного" белка или тиола.
127
§ 4. Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий
денатурации и диссоциации нативных белков
Как уже отмечалось, практически любой инактивационный процесс начинается
с обратимой стадии [N^D на схеме (1)] . Ее молекулярный механизм сводится
либо к обратимому конфор-мационному изменению (обратимая денатурация),
либо, в случае олигомерных белков, к обратимой диссоциации на
субъединицы. В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы
подавить первую стадию.
На основе подобных представлений разработан ряд общих принципов, следуя
которым можно в сотни и тысячи раз замедлить необратимую инактивацию
большого числа различающихся по структуре и функции ферментов. В
результате стало возможным проводить целенаправленный поиск конкретных
путей стабилизации как мономерных белков, так и ферментов с четвертичной
структурой, используемых в биотехнологии.
Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с применением метода
иммобилизации. В общем случае можно указать по крайней мере три причины
изменения стабильности в результате иммобилизации: 1) изменение
конформации иммобилизованного фермента по сравнению с нативной
структурой;
2) изменение микроокружения ферментной молекулы; 3) ужест-чение
нативной конформации белковой глобулы. Первые два фактора, по-видимому,
нельзя положить в основу разработки общих методов стабилизации ферментов.
Дело в том, что вопрос о связи стабильности белков с изменением их
конформации и микроокружения является малоизученным. Более того, такая
связь (даже если ее удастся установить) индивидуальна для каждого
фермента. Поэтому для целенаправленной стабилизации ферментов гораздо
более перспективным представляется третий путь - ужестчение (закрепление)
нативной конформации фермента с целью воспрепятствовать ее
разворачиванию. Следует отметить, что этот подход (увеличение жесткости
белков) широко используется природой при создании стабильных белков
термофильных микроорганизмов, живущих при повышенных температурах (50°С и
выше).
Многоточечное нековалентное взаимодействие фермента с носителем. В
принципе белковые молекулы могут связываться с теми носителями, на
поверхности которых имеются заряженные, гидрофобные, полярные группы, за
счет относительно слабых электростатических и гидрофобных взаимодействий,
водородных связей. Однако, поскольку эти связи слабые, они практически не
обрузуются в разбавленных растворах полимерных носителей. Дело в том, что
большие потери энтропии, происходящие при образовании комплекса белок -
носитель вследствие "замораживания" поступательного и вращательного
движения моле-
128
кул белка, не могут быть скомпенсированы за счет энергии образования
слабых нековалентных взаимодействий.
Ситуация существенно изменяется при включении ферментов в
концентрированные полимерные гели. Здесь в силу стерических препятствий,
вносимых частой пространственной сеткой полимера, поступательное и,
возможно, вращательное движение белковых молекул существенно заторможено.
В результате в таких системах образование комплекса белок - матрица
