Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
провести десятки тысяч циклов регенерации НАД.
В последние годы системы сопряженных ферментативных реакций находят все
большее применение в тонком органическом синтезе. В качестве примера
назовем реакцию окисления стероидов в присутствии 17-р-
оксистероиддегидрогеназы.
142
основной субстрат
побочный продукт
кофактор (восстановленный или окисленный)
вспомогательный субстрат
основной продукт
кофактор (окисленный или восстановленный)
Для регенерации окисленной формы НАД используется катализируемое
лактатдегидрогеназой восстановление пирувата.
Для придания большей технологичности промышленным процессам
разрабатываются процессы регенерации, основанные на применении
иммобилизованных ферментов и (или) коферментов. Так, процесс регенерации
НАД был осуществлен при использовании иммобилизованных в полупроницаемых
микрокапсулах алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Наряду с
иммобилизованными ферментами употребляется и иммобилизованный НАД,
например, связанный с растворимыми производными декстрана.
Для того чтобы система регенерации коферментов была экономически
выгодной, необходимо понизить стоимость вспомогательного субстрата. Это
было сделано с применением процесса на основе формиатдегидрогеназы и
НАДН-дегидрогеназы (А. М. Егоров, А. П. Осипов, 1978).
нсосг
формкагдепщрогеназа
со.
дкхлорфенолиндофенол
(восстановленный)
НАД НАДН
НАДН-дегидрогеназа
дихлорфенол индофенол (окисленный)
Неферментативные способы регенераци НАД(Н) и НАДФ(Н). К неферментативным
методам регенерации кофакторов относятся химические и электрохимические
способы. Ввиду своей низкой специфичности они меньше распространены, чем
ферментативные.
Химические методы. В качестве химических реагентов для регенерации НАДН
находят применение дитионит натрия и некоторые соли пиридиния.
Преимущество проведения регенерации в присутствии этих веществ
заключается в их относительно невысокой стоимости. Однако следует
отметить, что и дитионит натрия, и пиридиниевые -соли могут являться
ингибиторами ряда ферментов.
В последнее время в качестве реагента для химической регенерации НАД
применяется сравнительно дешевый флавин-мононуклеотид (ФМН).
Использование этого вещества обусловлено тем, что флавиновые коферменты
участвуют в процессах регенерации НАД in vivo. Иммобилизация ФМН на
полиэти-ленимине приводит к существенному увеличению скорости окисления
НАДН.
Удобным оказалось применять для регенерации пиридинди-нуклеотидных
коферментов различные красители, которые дают возможность определять
малые количества коферментов. Среди красителей наиболее употребимы
метиленовый голубой, тиазолил
143
голубой, акрифлавин, феназинметосульфат. Так, при использовании
последнего достигается до 10 000 циклов восстановления кофермента.
Электрохимические методы регенерации коферментов только начинают
развиваться. При проведении прямого электрохимического восстановления или
окисления кофермента могут возникать трудности, связанные с появлением
ферментативно неактивных форм в результате,. например, его димеризации.
Для преодоления этих трудностей проводят электрохимическое восстановление
иммобилизованного НАД. В качестве носителя используют водорастворимую
альгиновую кислоту.
Регенерация АТФ. АТФ- один из важных коферментов, участвующих в
ферментативных процессах образования новых химических связей. Для
регенерации АТФ применяют следующие методы: 1 - прямой химический синтез
из АМФ или АДФ и фосфорной кислоты; 2 - получение АТФ in vivo с
использованием дрожжей, бактерий, клеточных органелл; 3 - ферментативный
синтез in vitro.
Химический синтез АТФ. Осуществляется путем фосфорили-рования аденозина
или АМФ. В качестве фосфорилирующих агентов употребляются фосфорилхлорид,
фосфорная кислота и др. Реакция протекает в органическом растворителе.
Химический метод регенерации АТФ не очень удобен из-за образования
побочных продуктов, необходимости применения большого избытка
фосфорилирующего агента, а также из-за необходимости дальнейшей очистки
АТФ.
Регенерация АТФ с использованием целых клеток и органелл. Многие клетки и
клеточные органеллы содержат ферменты, катализирующие синтез АТФ из
аденозина, АМФ и неорганического фосфата. Так, для регенерации АТФ
используются дрожжи, а также субклеточные органеллы, такие, как
митохондрии, хлоропласты и хроматофоры. В последние годы для регенерации
АТФ начали применять иммобилизованные клетки.
Процесс регенерацит АТФ, происходящий с участием митохондрий, может быть
в сумме представлен следующим образом:
2НАДН + 2Н+ + 6 АДФ + 6Pi + 02 -> 2НАД+ + 8Н20 + 6 АТФ 2 пируват + 30АДФ
+ ЗОР, + 502 6С02 -f 34НгО + 30АТФ
К недостаткам этого процесса относятся: 1 - низкая стабильность систем; 2
- необходимость создания дополнительной системы регенерации НАД,
участвующего в первой реакции.
Значительно более перспективным в регенерации АТФ является использование
хроматофоров, способных осуществлять реакцию циклического
фосфорилирования. Преимуществом хроматофоров по сравнению с митохондриями
