Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
функциональных групп химическими реагентами (середина 50-х годов)
предпринимались неоднократные попытки стабилизировать ферменты методом
химической модификации. Анализируя эти попытки, удается выделить
следующие основные молекулярные причины повышения стабильности белков при
их ковалентной модификации:
1) в результате химической модификации белок может перейти в отличную от
нативной, например, более стабильную конформацию;
2) при химической модификации в белок зачастую вводятся новые
функциональные группы, способные завязать дополнительные стабилизирующие
белок водородные связи или солевые мостики;
3) химическая модификация неполярными соединениями иногда усиливает в
белках гидрофобные взаимодействия;
4) в результате модификации гидрофильными соединениями поверхностных
гидрофобных областей в белке уменьшается площадь неблагоприятного
контакта внешних неполярных остатков с водой, что должно стабилизовать
белок.
Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был
разработан метод, позволяющий получать измененные белки, отличающиеся от
белков-прототипов заменой всего лишь одного аминокислотного остатка в
строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод, названный сайт-
специфическим мутагенезом, или белковой инженерией^ интересен тем, что
позволяет целенаправленно' изменять структуру ферментов, а значит, их
каталитические свойства и стабильность.
Рассмотрим вкратце суть метода. Для белка с установленной первичной и
третичной структурой (известно более сотни таких белков) выбирают так
называемый сайт (или центр) мутации, т. е. тот аминокислотный остаток,
который подлежит замене. Поскольку in vivo мутация всегда осуществляется
при биосинтезе путем замены отдельных нуклеотидов в гене, то необходимо
перейти с языка структуры белка (аминокислотной последовательности) на
язык генетического кода. Для этого, во-первых, ищут (или создают
искусственным путем) кольцевую генетическую структуру - плазмиду, в
состав которой входит _С?н, кодирующий нужный белок. Во-вторых,
химическим путем сшН'ёзируют^'Тш^ длиной 12-18 основа-
ний. Его химический состав должен быть таков, чтобы соответствовать
небольшому участку первичной структуры выбранного белка (длиной 4-6
аминокислотных остатков), включающего сайт мутации. Однако в процессе
химического синтеза
133
вместо нуклеотидного трипдезд, кодирующего "нативную аминокислоту", в
состав нуклеотидной последовательности вводят другой триплет, который
кодирует . новый аминокислотный остаток. РПГ~бснове однонитевой плазмиды
и синтезированного олигонуклеотида ферментативным путем создают
гетеродуп-лексную двунитевую плазмиду, в состав которой входит "мутантный
ген", несущий информацию о структуре белка с заменой аминокислотного
остатка в определенном положении. Далее путем генетико-инженерных
манипуляций и клонирования гена получают клетки-трансформаторы, которые
осуществляют биосинтез мутантного запрограммированного исследователем
белка.
Использование метода белковой инженерии уже дало первые успехи в
стабилизации ферментов. Оценивая перспективы метода, следует помнить, что
он является и в течение некоторого времени будет оставаться довольно
дорогостоящим. Поэтому наиболее эффективным будет его использование в
случае тех ферментов, которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят,
и, во-вторых, инактивация которых связана с химической модификацией
какой-то "ключевой" группы, существенной для инактивации белка (например,
окислением SH-группы вблизи активного центра или дезамидированием
остатков аспарагина) .
Глава
gp- РЕГЕНЕРАЦИЯ |ш КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ LJ ФЕРМЕНТАМИ
Системы с иммобилизованными ферментами имеют относительно высокую
стоимость, поэтому крайне желательно добиться многократного их
использования. Иными словами, возникает проблема регенерации систем с
иммобилизованными ферментами или, по крайней мере, их отдельных, наиболее
дорогостоящих компонентов. К основным компонентам таких систем относятся
носители, ферменты и кофакторы. Как правило, не возникает необходимости
регенерировать носитель, так как используемые в промышленности носители
либо дешевы, либо стабильны. В то же время достаточно остро стоит вопрос
регенерации ферментов и кофакторов.
$ 1. Реактивация инактивированных ферментов
С точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне
заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться
возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса
ферментативным препаратам.
Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов
(начало XX в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации.
К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в
этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам,
вызывающим инактивацию.
Реактивация агрегированных белков. Ее часто удается осуществить, разрушив
межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические,
