Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
концентрациях от 30 до 300 мМ.
9. Получение наногранулированного а-химотрипсина. К 5 мл 0,235 М раствора
Аэрозоля ОТ в толуоле добавляют 100 мг акриламида и 25 мг М,М'-метилен-
бис-акриламида в 200 мкл воды и инициатор радикальной полимеризации, азо-
бис-изобу-тиронитрил, из расчета 0,1 мг/мл. Смесь встряхивают в течение
15-30 мин до полной солюбилизации. Затем к полученному раствору добавляют
100 мкл концентрированного (0,5 мМ) водного раствора акрилоилированного
а-химотрипсина (см. его получение в примере 3) и после встряхивания
получают однородный прозрачный раствор обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в
толуоле, содержащий солюбилизованные мономеры.
Полимеризацию инициируют облучением деаэрированного мицеллярного раствора
УФ-светом (ксеноновая лампа ХВО-200, расстояние от источника 33 см,
толщина слоя раствора 1см).
151
Для завершения полимеризации облучение продолжают в течение 10 мин.
После проведения полимеризации мицеллярную систему разрушают добавлением
10-кратного избытка ацетона. При этом полимерные наногранулы (размер
менее 100 нм в диаметре) выпадают в осадок, а растворимые в ацетоне
непрореагирбвавшие мономеры и Аэрозоль ОТ удаляют с супернатантом.
Полученный сухой порошок наногранулированного а-химотрипсина обладает до
40-60% ферментативной активности (от исходной), может храниться
практически без потери активности в течение полугода при 4°С, растворим
как в воде, так и в мицеллярных растворах в органических растворителях.
10. Гидрофобизация белков (на примере а-химотрипсина) для целей
нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях (биомембранах). К 10
мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 450 мкл 33 мМ боратного
буфера, pH 9,0. Раствор интенсивно встряхивают в течение 1-2 мин,
солюбилизуют в нем 20-50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем
добавляют ~ 100 мкл раствора стеароилхлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ в октане
(соотношение стеароилхлорид - белок составляет 2:1). Раствор перемешивают
в течение 20-30 мин.
Из реакционной системы белок осаждают на холоду добавлением двойного
объема ацетона, выпавший осадок белка отделяют и встряхивают с 20 мл
холодного ацетона для отмывки от примесей октана и Аэрозоля ОТ. Эту
операцию повторяют 2-3 раза. Остаток ацетона удаляют на роторном
испарителе (18°С) или током воздуха. Выход по белку контролируют по массе
и спектрофотометрически (280 нм).
Фракционирование стеароилированного химотрипсина проводят на колонке
(объем 210 мл) с сефадексом G-50, уравновешенным 1 мМ НС1. На колонку
наносят 10-20 мл 20 мкМ раствора белка, pH 3,0. Гидрофильную фракцию
элюируют 1 мМ НС1, гидрофобную - 0,5%-ным раствором Бридж 35, pH 3,0.
Выход модифицированного белка составляет ~85%.
ЛИТЕРАТУВЛ
Основная:
Введение в прикладную энзимологию/Под ред. И. В. Березина и К. Марти-
нека. - М.: Изд-во МГУ, 1982. 384 с.
Иммобилизованные ферменты//Современное состояние и перспектнвы/Под ред.
И. В. Березина, В. К. Антонова и К. Мартннека. - М.: Изд-во МГУ, 1976. Т.
1, 2. 296 с.; 358 с.
Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983. 213 с.
Мурье А. А. Хроматографические материалы. - М.: Химия, 1978.
Коршак В. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации
модификации природных соединений. - М.: Наука, 1984. 261 с.
Handbook of Enzyme Biotechnology Ed by A. Wiseman 2-nd edition -
Chichester: John Wiley and Sons, 1985. 437 p.
Methods in Ensymology//Immobilized Enzymes/Ed by K. Mosbch, - New York:
Academic Press, 1976. Vol. 44. 999 p.
Rosevear A. Immobilized biocatalysts - a critical review//J. Chem.
Technol. Biotechnol. 1984 . 34 B. P. 127-150.
Glazer A. N. The chemical modification of proteins by groupspecific and
site-specific reagents//In: The Protein. (H. Neurath, R. L. Hill, Eds). -
New-York. Academic Press, 1976. Vol. 2. P. 1-103.
Дополнительная:
Березин И. В.. Мартинек К. Основы физической химии ферментативного
катализа. - М.: Высшая школа, 1977. 280 с.
Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. - М.: Наука, 1978. 248 с.
Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука,
1985. 536 с.
Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества/Под ред. А. А.
Абрамзона и Е. Д. Щукина. - М.: Химия, 1984. 392 с.
Мартине к К., Березин И. В. Стабилизация ферментов - ключевой фактор при
внедрении биокатализа в практику//Успехи химнн. 1980. Т. 49. С. 737-770.
Можаев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению
фундаментальных проблем энзимологии//Успехи биологической химии. 1983. Т.
24. С. 99-134.
Хмельницкий Ю. М., Левашов А. В., Клячко Н. Л., Мартинек К¦ Микро-
гетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе
коллоидного раствора воды в органическом растворителе//Успехи химии.
1984. Т. 53. С. 545-565.
Мартинек К-. Левашов А. В., Клячко Н. Л.. Хмельницкий Ю. Л., Березин И.
В. Мицеллярная энзимология. Биол. мембраны. Т. 2. 1985. С. 669-696.
Исторический очерк
Биокаталнз//История моделирования опыта живой природы/Березин И. В.,
