Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
становится термодинамически гораздо более выгодным, поскольку здесь уже
не требуется затрат свободной энергии для погашения потерь поступательной
и вращательной энтропии ферментной глобулы при ее сорбции на полимерной
матрице. Благодаря этому в концентрированных полимерных гелях становится
возможным многоточечное взаимодействие (за счет слабых нековалентных сил)
фермента с носителем, поскольку в таких гелях^полимерные цепи со всех
сторон окружают ферментную глобулу. Такое многоточечное взаимодействие в
гелевых системах действительно имеет место; оно приводит к существенной
стабилизации ферментов. Так, а-химотрипсин, нековалентно включенный в
заряженный гель по-лиметакриловой кислоты, в 105 раз более термостабилен,
чем нативный фермент, если концентрация полимерных цепей в геле
составляет 50%.
Говоря о практическом применении гелевых систем, необходимо отметить один
их существенный недостаток. Частички геля склонны к набуханию в воде, что
приводит к снижению концентрации полимерных цепей в геле. В результате
эффект стабилизации включенного в гель фермента может уменьшаться и даже
вовсе исчезать, поскольку, как обсуждалось, для реалиазации
многоточечного нековалентного взаимодействия фермента с носителем
необходимо, чтобы гель был достаточно концентрированным. Поэтому
практическую ценность с точки зрения повышенной стабильности препарата
биокатализатора в суспензии имеют только те системы, в которых молекулы
фермента включены в "сильносшитые", ненабухающие в воде гелевые частицы.
Многоточечное ковалентное присоединение фермента к поверхности носителя
(рис. 24,а). Другой путь ужестчения структуры фермента заключается в его
иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных
связей. Для реализации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы
размеры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг другу.
Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то
такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность
носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем
случае не комплементарные друг другу.
Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммобилизации,
позволяющий создать полимерной носитель, комплементарный молекуле
фермента. Фермент химически модифицируют (например, по аминогруппам)
аналогом мономера, т. е.
129
Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-лизационных подходов к
стабилизации ферментов
соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хло-рангидридом
акриловой кислоты или акролеином). При последующей сополимеризации с
мономером (например, с акрила-мидом или метакрилатом натрия) белковая
глобула формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную
собственной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный метод
дает уникальную возможность получать препараты ферментов, пришитых
различным числом ковалентных связей к поверхности носителя, за счет
варьирования степени модификации на стадии обработки фермента аналогом
мономера.
Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной методике, обладают
гораздо более высокой устойчивостью против инактивации при повышенных
температурах, чем соответствующие нативные ферменты. Эффект стабилизации,
определяемый как отношение констант скоростей необратимой инактивации
нативного и иммобилизованного препаратов, возрастает с увеличением числа
связей между ферментом и носителем и достигает больших величин. Например,
для а-химотрипсина, пришитого к носителю 15 связями, стабилизационный
эффект составляет более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют
каталитическую активность при существенно более высоких температурах.
Так, например, оптимум эстеразной активности трипсина, ковалентно вшитого
в полиакриламидный гель 15 связями, наблюдается при температуре 75°С, что
на 25° выше оптимума активности нативного фермента. Это указывает на
резкое подавление быстрых обратимых денатурационных процессов в
иммобилизованном препарате.
Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобилизованного по
сополимеризационной методике фермента зависит только от числа ковалентных
связей с носителем, но не зависит ни от плотности гелевого носителя (т.
е. от концентрации полимера в геле), ни от степени его набухания. Более
того, проводя сополимеризационную иммобилизацию в отсутствие
бифункционального сшивающего агента, удается получить водорастворимые
130
ферментные препараты, также обладающие повышенной термостабильностью.
Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными реагентами (рис.
24,6). Модификация фермента бифункциональными агентами в принципе может
привести к наложению на белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных
сшивок. Следует ожидать, что сшивание увеличит конформационную жесткость
белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримолекулярное
сшивание белка) активно используется в природе для увеличения
стабильности белковых структур. К числу "природных сшивок" относятся как
