Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
вопрос о реактивации в таких более сложных случаях, по существу, сводится
к одной из трех вышеперечисленных ситуаций: реактивации агрегированных
белков, реактивации белков с измененной первичной структурой и
реактивации "необратимо денатурированных" ферментов или к различным
комбинациям этих трех случаев.
$ 2. Регенерация кофакторов (коферментов)
К категории кофакторов относятся коферменты, простети-ческие группы и
ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес
представляет регенерация коферментов. Коферменты - это низкомолекулярные
органические соединения, которые играют роль дополнительного субстрата в
функционировании многих ферментов. Примеры наиболее распространенных
коферментов приведены ниже.
Формула
Название
Окислительн о-в осстановительные системы
ОН ОН
СНг-О-Р-О-Р-О-С
О" о-
О
II
О
II
NH-
Никотинамидаденин-дияуклеотид (НАД)
ОН ОН
Неокислительн о-в осстановительные системы
NHi
о
Фл
дннуклеомд
(ФАД)
138
Кофсрмент Е (витамин В13)
Аскорбиновая
кислота
Ср*
^Fe .Fe Ферре до ксин
S | (фрагмент молекулы)
Cys / \
HL=U о-
но-снг-о-р-о-
НзС-l^J
П иридо ксал ьфосфат (витамин Вб)
139
Ж. N
X
I II
CH2-NH-С у-С-NH-CH-С
i-in J. O^^C- О
X
о
и
NH-СН-CH2-СН2-С-О Тетрагкдрофолат
HN ^NH
О
:н2-СН2-СН2-СН2-С-ОН Биотин
NH,
"О *NH3
о=с-<!:н-н2с-сн
N-^^N
Н3С-S-----СН- ^О.
ОН ОН
ун3
HS-(СН2)2-NH-С-(СН2)2-NH-с-сн-у-СН2-О-Р
о о i>H сн3 о
J
S-аденозилметионин
W
ЧР О СН;
II
О
Кофермент
А
ЬОН
Пуриновые фосфаты, например АТФ
Пиримидиновые фосфаты, например УДФ
140
Глутатион
Витамины А, Д, Е, К, например витамин А
При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами
приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его
удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем
ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для
регенерации разработано несколько подходов, суть которых отражается
следующей схемой:
субстрат-
продукт
кофактор
фермент
• (кофактор)
Л
система регенерации
У
Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного
из ферментов, благодаря системе сопряженных реакций регенерирует, т, е.
принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа
сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить
на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным
относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или
сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на
химические и электрохимические. В качестве примера подробно остановимся
на пиридиндинуклеотидных коферментах НАД(Н) и НАДФ(Н), способы
регенерации которых разработаны наиболее полно.
Ферментативные способы регенерации НАД(Н) и НАДФ(Н). Использование
сопряженных субстратов.
Регенерация коферментов может быть проведена, если в систему ввести
избыточное количество сопряженного субстрата того же фермента,
катализирующего реакцию в обратном направлении. Схематически принцип
метода выглядит следующим образом:
основной субстрат ---------------основной продукт
кофактор [ \ кофактор
(окисленный или т фермент 1 (восстановленный
восстановленный) \ J или окисленный)
побочный продукт -*---------------- сопряженный субстрат
141
Системы регенерации НАД на основе алкогольдегидроге-назы из печени лошади
впервые были предложены Дж. Ван Ей-сом. Один из применяемых процессов -
это процесс восстановления лактальдегида в пропан-1,2-диол:
Н+ + СН3СН(ОН)СНО + НАДН ^ СН3СН(ОН)СНЮН-|-НАД+
В присутствии сопряженного субстрата, этанола, число циклов НАД может
достигать 800.
Разработаны также методы регенерации, основанные на других парах
сопряженных субстратов, в частности циклогекса-нол и п-нитрозо-Ы,Ы'-
диметиланилин. Преимущество использования этой пары заключается в
возможности непрерывного слежения за реакцией восстановления л-нитрозо-
Н,М'-диметил-анилина.
Недостатки использования сопряженных субстратов в процессах регенерации
НАД связаны с тем, что, во-первых, равновесие реакции альдегид ^ спирт
сильно сдвинуто в сторону спирта (что 'требует высоких концентраций
сопряженного субстрата) и, во-вторых, выделение основного продукта из
смеси затруднено. Применение известных методов иммобилизации ферментов и
коферментов будет способствовать преодолению возникшей проблемы.
Использование сопряженных ферментативных реакций. Суть этого способа
регенерации заключается в том, что в реакцию, катализируемую ферментом А,
дополнительно вводится фермент Б, в функционировании которого участвует
сопряженная форма кофермента:
Существенным для данного способа регенерации кофермента является различие
в специфичности используемых ферментов для исключения возможной
конкуренции основных и побочных субстратов и продуктов.
В числе удачных систем регенерации НАД могут быть названы системы
лактатдегидрогеназа - глутаматдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа -
алкогольдегидрогеназа. Так, включение последней системы позволяет
