Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
отношении, в будущем здесь следует ожидать лишь детализации отдельных
приемов, а наибольший интерес и перспективы связаны с ее практическим
использованием. И в этой связи хотелось обратить внимание, что идеи
иммобилизации и ее методология приложимы не только к ферментам, но и
многим другим соединениям, как высоко-, так и низкомолекулярным
(гормонам, витаминам, лекарственным веществам и т. п.).
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК
1. Иммобилизация трипсина на целлюлозе. 10 мл 6%-ного раствора перйодата
натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Перемешивают смесь в течение 3 ч,
затем осадок отделяют и промывают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл
0,1 М трисового буфера, pH 8,0, содержащего 10 мМ СаС12 для уменьшения
автолиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина зависит
от его удельной активности и, как правило, это 100 мг. Смесь инкубируют
при перемешивании в течение 1-3 ч. Точное время инкубации устанавливают
экспериментально, определяя удельную активность нативного трипсина и
активность в супернатанте для расчета количества фермента, связавшегося с
носителем. Пробы для измерения активности супернатанта следует отбирать в
процессе иммобилизации через каждые 20-30 мин. Полученный препарат
иммобилизованного фермента отделяют фильтрованием, промывают буферным
раствором и насыщенным раствором мочевины для удаления не связавшегося с
носителем фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного
трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при 4°С практически
без потери активности.
2. Определение ферментативной активности иммобилизован' ного трипсина.
Определение проводят, измеряя скорость ферментативного гидролиза
этилового эфира N-бензоил-Ь-аргинина, потенциометрически на pH-стате. Для
этого из инкубационной смеси отбирают пробы по 0,5-1,0 мл и помещают в
ячейку pH-стата, содержащую 10_3 М субстрата (pH около 7), 0,1 М KCI и 10
мМ СаС12. Измеряют активность отобранных проб, учитывая фоновую реакцию
гидролиза субстрата в отсутствие фермента.
3. Ковалентная иммобилизация а-химотрипсина в полиакриламидном геле.
Процедура иммобилизации включает две стадии: модификацию хлорангидридом
акриловой кислоты и включение в гель.
а) К раствору 5-20 мг химотрипсина в 10 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH
8,0, при 0°С добавляют 10-100 мкл хлорангид-рида акриловой кислоты
порциями по 10 мкл при интенсивном
148
перемешивании. После добавления каждой новой порции хлор-ангидрида
акриловой кислоты инкубируют раствор в течение 5 мин, доводят pH до 8,0,
добавляя концентрированный раствор КОН; затем вносят новую порцию
модификатора. После завершения модификации раствор инкубируют при 0°С без
перемешивания в течение 30 мин.
б) К раствору модифицированного фермента (10 мл) последовательно
добавляют 3,33 г акриламида, 0,2 г М,М'-метилен-бис-акриламида и 0,1 мл
10%-ного водного раствора N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина, доводят pH
до -8,0 концентрированной НС1 и далее добавляют 20 мг персульфата аммония
в виде 20%-ного раствора. Раствор быстро (в течение нескольких секунд)
перемешивают, разливают в тонкостенные стеклянные пробирки диаметром 5 мм
и инкубируют в течение суток при 4°С. Полученный гель извлекают из
пробирок, измельчают, растирая в ступке, и инкубируют в течение суток в
0,1 М трисовом буфере, pH 8,0, при 20°С. Суспензию переносят на
стеклянный фильтр G-2 (пор-100), промывают несколькими объемами
дистиллированной воды, высушивают гель на фильтре в течение нескольких
минут. Удельная активность иммобилизованного а-химотрипсина составляет
0,1-0,3 мг фермента на 1 г геля.
4. Определение активности иммобилизованного а-химотрипси-на. Определение
проводят потенциометрически, измеряя скорость ферментативного гидролиза
специфического субстрата этилового эфира N-ацетил-Ь-тирозина на pH-стате.
Для этого навеску иммобилизованного фермента (0,05-1,0 г) помещают в
ячейку pH-стата с 5-10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС1 (pH 8,0) и
измеряют активность препарата фермента, учитывая фоновую реакцию
гидролиза субстрата в отсутствие фермента.
5. Реактивация термоинактивированного иммобилизованного трипсина.
Препарат иммобилизованного трипсина (0,2-1 г) после термоинактивации
(остаточная активность 5-15% от уровня активности препарата фермента до
термоинактивации) вносят в 4 мл раствора 10 М мочевины (pH 3) и
инкубируют в течение 30 мин. Затем доводят pH до 8,5 концентрированным
раствором КОН и в суспензию добавляют 1 мл 0,1 М раствора трисового
буфера (pH 8,5), содержащего 10 мг дитиотреитола - реагента,
расщепляющего S-S-связи в белках. Суспензию инкубируют в течение 3 ч при
20°С в атмосфере инертного газа (азота или аргона). После инкубации
препарат иммобилизованного трипсина переносят на стеклянный фильтр G-3
(пор-40) и промывают 1 мМ раствором HCI и 5%-ным раствором уксусной
кислоты несколько раз порциями по 10-20 мл до исчезновения запаха
дитиотреитола. Промывание препарата проводят в токе инертного газа, ее
