Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
отсутствие внутридиффузионных ограничений, лишь множителем F, который
называют фактором эффективности и который отражает влияние
внутридиффузионных ограничений на ферментативный процесс. На рис. 17
приведена зависимость F от al. При 1 F отличается от единицы не более чем
на 10%, т. е. влиянием диффузии на кинетику ферментативной реакции можно
пренебречь. При a/>l F заметно меньше единицы. Иными словами, отличие а/
от единицы может служить критерием влияния диффузии на скорость реакции,
катализируемой иммобилизованным ферментом.
3. [S]o ~ /См, каж- В этих условиях получаем следующее выра-
ЖеНИС: *кат[?] И о (П)
где If3** См.каж + So
А Лм, каж р
Таким образом, роль внутридиффузионных ограничений в кинетике реакций,
катализируемых иммобилизованными ферментами, сводится к увеличению
кажущейся константы Михаэлиса.
При выводе уравнений для рассмотренных систем делалось допущение, что
частицы носителя с иммобилизованным ферментом представляют собой плоские
мембраны. Однако в общем случае форма частиц может быть иной -
сферической, цилиндрической, неправильной. Решение задачи в случае частиц
носителя произвольной формы приводит к следующему выражению для наблюда-
106
емой скорости ферментативной реакции, контролируемой диффузией:
Рнабл. = Т)0, где v - скорость реакции в отсутствие диффузионных
ограничений; Tj - фактор эффективности, который зависит от параметра Ф,
называемого модулем Тиле. Хотя конкретный вид функции tj (Ф) зависит от
формы частицы и порядка реакции по субстрату, но очень часто описывается
кривой, аналогичной виду зависимости F от аI (рис. 17).
Таким образом параметр а/, характеризующий внутреннюю диффузию в плоской
мембране, является частным случаем модуля Тиле. Для оценки роли
внутренней диффузии в конкретной системе с иммобилизованным ферментом в
принципе необходимо вычислить модуль Тиле Ф и, основываясь на рис. 17,
сравнить соответствующее значение rj с единицей.
Способы различия внутридиффузионных и внешнедиффузионных ограничений.
Существует два основных экспериментальных критерия, по которым можно
определить, протекает ли реакция, катализируемая иммобилизованным
ферментом, во внутридиффу-зионном или внешнедиффузионном режиме. Они
основаны на различной чувствительности кинетических параметров
ферментативных процессов, контролируемых внешней и внутренней диффузией
субстрата, к действию специфических лигандов и температуры.
Для внутридиффузионно-контролируемых реакций при очень больших значениях
а/, когда F 1, т. е. ферментативная реакция существенно замедлена
диффузией, имеем Км, каж [S]o- В этом случае для общей скорости
ферментативной реакции, отнесенной к объему носителя, справедливо
выражение
v = 2PC0 |/ feKaT[?]D
AM, каж
Видно, что скорость реакции пропорциональна квадратному корню из
концентрации фермента и его активности (feKaT)- Эта ситуация существенно
отличается от случая внешнедиффузионных ограничений, когда скорость
реакции в диффузионной области не зависит от каталитических свойств
фермента. В частности, ферментативные реакции, контролируемые внутренней
диффузией, "чувствуют" эффекты ингибирования, pH-зависимость активности и
т. п.
Как было отмечено выше, температурные зависимости реакций,
F
Рис. 17. Вид зависимости фактора эффективности (f) ферментативной реакции
от al:
а - параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками
системы с иммобилизованным ферментом, / - толщина мембраны
107
контролируемых внешнедиффузионными ограничениями, целиком определяются
чувствительностью к температуре коэффициента диффузии D (энергии
активации порядка 15-20 кДж/моль). Иная ситуация реализуется для
процессов, контролируемых внут-ридиффузионными ограничениями. Здесь
кажущееся значение энергии активации зависит от температурного хода как
кинетического ( /Акат/Км.каж) и диффузионного параметров, так и
коэффициента распределения Р субстрата между раствором и фазой носителя
[уравнение (12)] и, как правило, характеризуется более высокими
численными значениями (больше 40 кДж/моль).
Стерические ограничения в катализе иммобилизованными ферментами.
Пространственная сетка матрицы, в которой иммобилизован фермент, может
препятствовать продвижению молекул субстрата, например, в силу чисто
механических причин. В результате активные центры части ферментных
молекул оказываются недоступными для субстрата. Фактически это означает
снижение концентрации активного фермента и приводит к уменьшению
наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно, хотя истинные
каталитические параметры и не изменились, фермент не может полностью
проявить свою потенциальную активность.
Уменьшение каталитической активности фермента за счет сте-рических
факторов проявляется особенно часто в случае высокомолекулярных
субстратов. Поэтому при создании биокатализаторов, действующих на белки,
нуклеиновые кислоты и другие природные биополимеры, предпочтительнее
иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой
