Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
иммобилизованным ферментом, от температуры может служить указанием на то,
что процесс протекает в диффузионном режиме. Однако с повышением
температуры реакция может переходить из кинетической области в
диффузионную, поскольку р и V/Км в уравнении (7) по-разному зависят от
температуры.
Зависимость скорости реакции от удельной концентрации иммобилизованного
фермента (количества активного фермента на 1 г носителя). Как видно из
анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузионной области не должна
изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного
фермента. Кроме того, скорость диффузионно-контролируемых реакций не
должна также зависеть от таких факторов, как изменение pH, ионной силы,
добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают специфическое
влияние исключительно на ферментативные стадии (что легко проследить в
случае нативного фермента). Следует, однако, учитывать, что для одного и
того же препарата иммобилизованного фермента реакция со специфическим
(высокореакционноспособным) субстратом может быть диффузионно
контролируемой, а с неспецифическим субстратом (менее
реакционноспособным) протекать в кинетической области.
Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с
иммобилизованным ферментом. Скорость реакции в кинетической области не
104
должна зависеть от степени измельчения частиц, содержащих катализатор
(если, конечно, нет внутридиффузионных затруднений для субстрата, см.
ниже). С другой стороны, скорость диффузионно-контролируемых реакций
будет возрастать по мере уменьшения размера частиц с иммобилизованным
ферментом, поскольку такое уменьшение приводит к увеличению диффузионного
параметра р в уравнении (7).
Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов
ослабляется по мере ускорения массопереноса путем более интенсивного
перемешивания. Этот вывод становится особенно очевидным, если встать на
позиции представлений о неперемешиваемом слое (слое Нернста) как о
физической реальности, для которой применим первый закон Фика. Из
гидродинамики следует, что толщина неперемеши-ваемого слоя уменьшается
при увеличении скорости потока жидкости вокруг частицы. Таким образом,
зависимость наблюдаемой скорости ферментативной реакции от скорости
перемешивания или скорости протока субстрата указывает на существенную
роль диффузии в процессе. Увеличение скорости протока субстрата через
колоночный реактор и повышение числа оборотов мешалки в реакторе
перемешивания должно ослабить диффузионные ограничения. Существенное
ускорение перемешивания может, в принципе, перевести реакцию из
диффузионной области в кинетическую.
Внутрибиффузионное торможение. Реакция, катализируемая ферментом,
иммобилизованным внутри частицы (например, включенным в полимерный гель),
может оказаться чувствительной к торможению за счет внутренней диффузии.
Иными словами, скорость ферментативной реакции может лимитироваться
скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутридиф-фузионное
торможение ферментативных реакций зависит от формы частицы с
иммобилизованным ферментом.
Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана толщиной /,
содержащая иммобилизованный фермент с концентрацией в мембране [?].
Мембрана погружена в раствор субстрата, концентрация которого равна [S].
Коэффициент распределения субстрата между раствором и мембраной равен Р.
Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе
и кинетическими параметрами (ftKaT и Км,каж) ферментативной реакции.
В соответствии со вторым законом Фика скорость диффузии субстрата в
мембрану (в направлении х, перпендикулярном ее поверхности - см. рис. 16)
равна D ^ ^ , где D - коэффициент диффузии субстрата. В стационарном
состоянии системы скорости ферментативной реакции, задаваемой уравнением
Михаэлиса- Ментен [уравнение (1)], и диффузии субстрата равны. Этому
условию соответствует следующее равенство:
D d2[S] fenaT[?] [•Sjo
дх2 Km."."+[S]o ' 1'
105
При анализе уравнения (8) возможны три частных случая.
1. [S]o3> Кк. каж- Тогда выражение скорости ферментативной реакции,
отнесенной к единице объема матрицы (о), примет следующий вид:
V = ?кат [f], (9)
Очевидно, что в этом случае диффузия не влияет на скорость ферментативной
реакции.
2. [S]0 <С /См.каж- Тогда справедливо выражение
^кат[?] [S]o 2 cosh а/-1
Рис. 16. Схематическое изображение диффузии субстрата в плоскую мембрану
толщиной I Прямая I описывает распределение субстрата в начальный момент
времени (/ = 0); прямвя 2-равновесное распределение субстрата в
отсутствие ферментативной реакции в мембране; кривая 3 - распределение
субстрата при наличии ферментативного процесса в мембране после
установления стационарного состояния
где
КМ, каж
а=
а/
sin/m/
(Ю)
kbalE
I - толщина
^См, кажР
мембраны.
Видно, что вклад диффузии учитывается фактором F
2 cos ha/ - I
F =
al
Ментен, справедливого в
sin ha/ ' а выражение (10) отличается от обычного уравнения Михаэлиса -
