Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
поверхности носителя.
Для технологического использования наиболее удобен-werojBL нанесения в
колонке. Существует две модификации этого метода', ^^одао^^з^нихчёрез
колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают в
направлении сверху вниз раствор
47
колонка с носителем
Рис. 3. Способы адсорбционной иммобилизации ферментов
фермента в режиме непрерывной циркуляции (рис. 3,г). В другом варианте
метода направление потока изменено на противоположное, т. е. раствор
фермента подается в нижнюю часть колонки (рис. 3,д), причем скорость
потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались во взвешенном
состоянии, образуя "кипящий слой". Метод нанесения в колонке обладает тем
преимуществом, что позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а
затем и сам ферментативный процесс в одной и той же колонке без
дополнительных манипуляций с носителем.
48
§ 3. Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем
I Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя
может обеспечиваться за счет неспецифических вйн-дер-ваальсовых
взаимодействий, электростатических взаимодействий, водородных связей и
гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами
белка. Относительный вклад каждого из типов связывания зависит от
химической природы носителя и функциональных групп на поверхности
молекулы фермента. В большинстве случаев основную роль в связывании
фермента играют электростатические взаимодействия и водородные связи.
Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что
сорбция биокатализатора будет сопровождаться разрушением его структуры.
Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах
цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности
частиц носителя.
§ 4. Влияние различных факторов на адсорбцию ферментов на носителе
Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фермента с носителем
в значительной степени зависят от условий проведения иммобилизации.
Основными факторами, влияющими на адсорбцию фермента, являются удельная
поверхность и пористость носителя, значения pH и ионной силы раствора
фермента, его концентрация и температура проведения процесса адсорбции.
Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная емкость носителя
пропорциональна его удельной поверхности. В приложении к белкам
(ферментам) эта закономерность, однако, действует только в том случае,
когда носитель непористый или когда диаметр пор намного превосходит
размер белковых молекул. Если же поры настолько малы, что не могут
вместить молекулу фермента, то для белка оказывается доступной только
часть общей поверхности, т. е. сорбционная емкость носителя по отношению
к ферменту небольшая, несмотря на очень большую общую удельную
поверхность. Критерий для определения оптимального размера пор носителя
для адсорбционной иммобилизации ферментов был предложен Р. Мессингом
(1976), который изучал адсорбцию различных ферментов на пористом стекле и
керамических носителях с калиброванным размером пор. В соответствии с
этим критерием диаметр пор должен приблизительно в два раза превосходить
размер молекулы белка в направлении ее максимального удлинения. При этом
предполагается,' что молекулярные размеры субстрата намного меньше, чем
фермента, так что молекула субстрата заведомо способна проникнуть в пору,
где находится сорбирован-
49
ный фермент. В том случае, если субстратом является вещество с очень
большой молекулярной массой, выбор диаметра пор носителя может
диктоваться уже размерами молекулы субстрата. Более того,
высокомолекулярный субстрат сам может служить носителем для иммобилизации
фермента. Например, для адсорбционной иммобилизации ферментов
целлюлазного комплекса был успешно использован его субстрат - целлюлоза.
Значение pH. Реакция среды оказывает очень сильное влияние на
эффективность сорбции фермента на поверхности носителя, особенно, если
сорбция осуществляется главным образом за счет электростатических
взаимодействий. Причина этого влияния состоит в том, что при изменении pH
меняется состояние ионизации ионогенных групп носителя и белка,
ответственных за связывание. При использовании носителей, не являющихся
ионообменниками, максимальная адсорбция обычно достигается в
изоэлектрической точке белка. Иными словами, рН-за-висимость адсорбции
должна иметь вид кривой с одним максимумом, соответствующим значению
изоэлектрической точки. Однако известны случаи, когда это правило
нарушается. Например, pH-зависимость эффективности адсорбции альбумина на
латексе имеет вид W-образной кривой, а значение pH, при котором
достигается максимальная адсорбция этого белка на угле, изменяется от 3
до 6 в зависимости от типа последнего.
Ионная сила. Значение этой величины оказывает влияние на прочность
связывания фермента с носителем. При высокой концентрации солей
присутствующие в растворе ионы вытесняют с поверхности носителя связанные
