Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
полимеризацию, в результате которой образуется полимерный гель с
включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто
добавляют также бифункциональные (т. е. содержащие в молекуле две двойные
связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру
трехмерной сетки (рис. 7,с).
Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель, полученный путем
полимеризации низкомолекулярного мономера (о) и готового полимера (б)
57
Впервые этот способ был использован П. Берифельдом и Дж. Уэном (1963),
которые осуществляли иммобилизацию ряда ферментов (таких, как трипсин,
рибонуклеаза и р-амилаза) в геле, полученном радикальной полимеризацией
Ы,Ы'-метилен-бис-акриламида.
Альтернативный способ состоит в том, что фермент вносят в раствор уже
готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в
гелеобразное состояние (рис. 7,6). Рассмотрим эти подходы подробнее*.
§ 7. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров
Органические гели. Суть методики. Для проведения иммобилизации готовят
реакционную смесь, главными компонентами которой являются фермент,
мономер, сшивающий агент (если это необходимо) и водный буферный раствор.
Иногда в смесь для полимеризации вводят также добавки, предохраняющие
фермент от инактивации при гелеобразовании. Для получения геля готовую
смесь подвергают воздействию какого-либо фактора, инициирующего процесс
полимеризации мономера.
Полимеризация. При проведении полимеризации обычно используемые
концентрации мономера и сшивки составляют, соответственно, 30-60% и
приблизительно 5% от общей массы реакционной смеси. Полимеризация
протекает по радикальному механизму. Источниками радикалов, являющихся
инициаторами процесса полимеризации, могут служить некоторые
окислительно-восстановительные и фотохимические реакции, в ходе которых в
качестве промежуточного продукта образуются свободные радикалы. Наиболее
широко применяется окислительно-восстановительная пара персульфат калия
(или аммония) - N.N.N'.N'-тетраметилэтилендиамйн. Инициирование
полимеризации достигается при внесении этих веществ в раствор мономера. В
качестве фотохимического инициатора обычно используется рибофлавин; в
этом случае полимеризация происходит при облучении реакционной смеси
мощным источником света. Свободные радикалы, необходимые для начала
полимеризации, могут генерироваться также при воздействии на раствор
мономера у-из-лучения или потока электронов. Преимущество этого способа
состоит в том, что он не требует введения инициаторов в исходную смесь.
* В принципе, иммобилизацию путем включения в гель можно осуществить
также, пропитывая уже готовый гель раствором фермента. Этог способ,
отнако, не имеет широкого практического применения, поскольку получаемые
с его помощью препараты иммобилизованных фермешов характеризуются низкой
удельной активностью, а сам процесс иммобилизации занимает длительное
время из-за низкой скорости диффузии фермента в порах геля. Одно из
немногих исключений составляет описанная ниже иммобилизация на
коллагеновых мембранах путем их импрегнирования водным раствором
фермента.
58
При проведении иммобилизации могут возникать затруднения, обусловленные
некоторыми особенностями протекания реакции полимеризации. Так, например,
полимеризация ингибируется присутствующим в растворе молекулярным
кислородом, и во многих случаях для его удаления рабочий раствор
предварительно насыщают инертным газом - азотом или аргоном. Кроме того,
в ходе полимеризации выделяется значительное количество теплоты, что
приводит к повышению температуры внутри образующегося полимерного блока
до 75°С. Такое сильное нагревание вызывает инактивацию ферментов, поэтому
полимеризую-щийся раствор необходимо охлаждать так, чтобы его температура
не превышала 20-25°С.
Осложнений, связанных с ингибирующим действием кислорода и нагреванием,
можно избежать, если проводить полимеризацию путем у-облучения
замороженного и охлажденного до -80°С рабочего раствора. -
После окончания полимеризации, которая в зависимости от условий (природа
мономеров, количество инициатора, температура и т. п.) может продолжаться
от нескольких минут до нескольких часов, образуется блок полимерного
геля, содержащий иммобилизованный фермент. Следует учитывать, что в геле
могут оставаться примеси неизрасходованных при полимеризации мономеров и
инициаторов. Чтобы избавиться от них, гель обычно механически измельчают
и тщательно промывают буферным раствором. При необходимости длительного
хранения измельченные частицы подвергают лиофильной сушке.
Инактивация фермента при полимеризации. В процессе образования
полимерного геля фермент подвергается различным денатурирующим
воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть
до полной потери каталитической активности. Помимо уже упоминавшегося
возможного разогрева при полимеризации денатурацию фермента могут
вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь мономер.
