Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
за счет электростатических взаимодействий белковые молекулы. Иными
словами, возрастание ионной силы вызывает десорбцию фермента. Однако
иногда эта закономерность не действует, и увеличение концентрации соли,
наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе. В таких случаях
принято говорить об эффекте "высаливания" белка из раствора.
Концентрация фермента. При возрастании концентрации фермента в растворе,
из которого происходит адсорбция, количество сорбировавшегося на носителе
фермента увеличивается и соответственно растет удельная каталитическая
активность иммобилизованного препарата. Зависимость удельной
каталитической активности от исходной концентрации фермента, как правило,
имеет вид кривой с насыщением, что свидетельствует о существовании лишь
ограниченного числа центров связывания фермента на поверхности носителя,
которые к тому же обладают неодинаковым сродством по отношению к белку.
При дальнейшем повышении концентрации фермента в растворе может
происходить образование поверх первого слоя адсорбированного фермента
второго и последующих слоев. Наибольшей каталитической активностью
обладают верхние слои адсорбированного фермента, где ограничения,
накладываемые на скорость реакции диффузией субстрата, минимальны.
Поэтому излишняя
50
"перегрузка" носителя ферментом приводит к тому, что более глубоко
расположенные слои адсорбированного биокатализатора исключаются из сферы
реакции, и в результате общая эффективность использования фермента
снижается.
Температура. Повышение температуры оказывает двоякое воздействие на
процесс адсорбционной иммобилизации. С одной стороны, сильное нагревание
приводит к потере ферментативной активности вследствие тепловой
денатурации белковой глобулы. С другой стороны, рост температуры обычно
обеспечивает ускорение процесса благодаря повышению скорости диффузии
молекул фермента в порах носителя. Следовательно, должна существовать
некоторая оптимальная температура для проведения адсорбционной
иммобилизации. Точное значение оптимальной температуры зависит от природы
адсорбируемого фермента и поверхности носителя.
Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилизации ферментов
определяется тонким балансом целого ряда факторов. Нарушение этого
баланса вследствие изменения (порой незначительного) какого-либо из
внешних условий может привести к резкому ослаблению взаимодействия
фермента с носителем и, следовательно, к его десорбции. Чтобы избежать
этого нежелательного явления, на практике используется ряд методических
приемов, некоторые .из которых рассмотрены в следующем разделе.
§ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем
Иммобилизация на предварительно модифицированных носителях.
Предварительная модификация носителя во многих случаях позволяет
существенно повысить прочность связывания адсорбционно-иммобилизованного
фермента. Следует подчеркнуть, что помимо увеличения эффективности
сорбции модификация носителя нередко обеспечивает также улучшение
каталитических свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию для
его молекул благоприятного микроокружения. Более того, без
предварительной модификации носителя иногда вообще не удается сохранить
каталитическую активность фермента при адсорбционной иммобилизации.
Например, если фермент обладает низкой стабильностью в кислой области pH,
то при его адсорбции на силикагеле может произойти потеря каталитической
активности, поскольку поверхность этого носителя имеет кислый характер(рН
~4). Для предотвращения инактивации фермента силикагель перед проведением
иммобилизации необходимо выдержать некоторое время в буферном растворе с
таким значением pH, которое является оптимальным для данного фермента.
Аналогичная проблема часто возникает при адсорбционной иммобилизации
ферментов, которым для нормального функционирования необходимо
присутствие в активном центре иона ме-
51
талла. Дело в том, что большинство носителей способны селективно и прочно
сорбировать ионы металлов, поэтому при адсорбционной иммобилизации
металлозависимых ферментов может происходить частичная или полная потеря
каталитической активности, обусловленная выходом иона металла из
активного центра фермента и его связыванием на поверхности носителя. Это
нежелательное явление можно устранить, если до проведения иммобилизации
обработать носитель избытком раствора, содержащего ионы соответствующего
металла, и тем самым насытить центры сорбции ионов металла на носителе.
Предварительная обработка носителя ионами металлов применяется также и
для повышения прочности связывания адсорбционно-иммобилизованных
ферментов. Увеличение эффективности сорбции достигается в этом случае за
счет образования комплекса белка с ионами переходных металлов (таких, как
Ti, Sn, Zr, V, Fe), которые, в свою очередь, прочно связаны с
поверхностью носителя (рис. 4,с). Иными словами, иои металла выступает в
роли мостика, соединяющего молекулу фермента с носителем. Этот метод дает
