Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
хорошие результаты при иммобилизации различных ферментов на таких
носителях, как, например, целлюлоза, найлон, стекло, фильтровальная
бумага и т. д.
Способ, основанный на обработке носителя ионами металлов, может служить
хорошей иллюстрацией одного из главных принципов, лежащих в основе
применения модифицированных носителей: модификация должна придавать
носителю такие свойства, благодаря которым усиливается его способность к
связыванию ферментов.
Один из возможных путей достижения этой цели состоит, помимо
использования ионов металлов, в обработке носителя веществами, молекулы
которых содержат большое число функциональных групп, способных
взаимодействовать с группами на поверхности ферментной глобулы за счет
электростатических и водородных связей (рис. 4,6). Например,
полимеризация на поверхности силохрома акриловой кислоты, винилацетата и
т. п. с последующей химической модификацией полимера приводит к
образованию носителя, характеризующегося высокой поверхностной
концентрацией функциональных групп (гидроксильных, аминоалкильных,
аминоарильных и гидразидных). В качестве модификатора часто используется
также альбумин, который наносится на носитель путем адсорбции, а затем
подвергается денатурации нагреванием. Слой денатурированного альбумина
образует на поверхности носителя "мягкую" подложку с большим числом
функциональных групп, способную прочно связывать молекулы фермента,
одновременно обеспечивая для них благоприятное микроокружение. В
результате во многих случаях при обработке альбумином удается добиться
повышения эффективности сорбции и улучшения каталитических характеристик
иммобилизованного фермента.
52
Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно
модифицированных носителях
Для повышения эффективности сорбции может быть также использована
модификация носителя гидрофобными соединениями. Связывание фермента с
такими носителями обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий между
модификатором и неполярными участками на поверхности белковой глобулы.
При этом способе иммобилизации применяются те же носители, которые
используются при гидрофобной хроматографии белков. В первую очередь к ним
относятся различные агарозы, ковалентно модифицированные гидрофобными
группами (алкильными, фенильными и т. п.). На конце такой гидрофобной
"ножки" может присутствовать также и заряженная группа, благодаря чему
обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно за счет
электростатических и гидрофобных сил (рис. 4, в). При таком
"многоточечном" связывании сорбция многих ферментов протекает практически
необратимо. Эффект многоточечного связывания достигается также при
использовании полисахаридных носителей, модифицированных танином -
природным дубящим веществом, содержащим большое число фенольных групп.
Танин может быть либо адсорбирован на носителе, либо связан с ним
химически. Удерживание фермента на
53
поверхности обработанных танином носителей обеспечивается за счет
электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий.
Эффективность сорбции фермента может быть увеличена также при
использовании носителей, предварительно модифицированных путем адсорбции
монослоя липида (см. гл. 1). Используя носители с той или иной
ориентацией липидных молекул в адсорбированном монослое, можно добиться
максимальной эффективности сорбции как гидрофильных (рис. 4,г), так и
гидрофобных (рис. 4,d) ферментов.
Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной пришивки к его
поверхности молекул, являющихся специфическими лигандами иммобилизуемого
фермента. Иммобилизация с использованием таких носителей достигается за
счет образования прочного нековалентного комплекса между ферментом и
связанным с носителем лигандом. Этот метод иммобилизации, получивший
название аффинной сорбции, широко используется в лабораторной практике,
например, для избирательного выделения ферментов из сложных смесей
(аффинная хроматография).
Иммобилизация предварительно модифицированных ферментов. При
адсорбционной иммобилизации на ионообменниках часто возникают
затруднения, связанные с тем, что для многих ферментов изоэлектрическая
точка и pH-оптимум каталитической активности очень близки. Поэтому
прочная сорбция наблюдается лишь в областях pH, далеких от изоэлектри-
ческой точки, где каталитическая активность мала. Чтобы преодолеть это
препятствие, был разработан метод иммобилизации, ферментов,
предварительно модифицированных введением ионогенных групп (поликислоты,
карбоксиметилцел-люлоза, остатки янтарной кислоты и т. п.). Например, при
модификации а-химо-трипсина хлортриазиновым красителем (активным ярко-
оранжевым КХ) изоэлектрическая точка фермента сдвигается в щелочную
область. В результате этого модифицированный а-химо-трипсин достаточно
хорошо сорбируется на многих ионообменниках с сохранением
Рис. 5. Адсорбционная иммобилизация предварительно модифицированных
ферментов
54
каталитической активности. Другой пример - модификация а-химотрипсина
