Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
этом производное фермента является практически неактивным и не регенерирует фермент за время эксперимента (так называемое «титрование активных центров», рис. 92). В реакции гидролиза n-нитрофенилгиппурата, катализируемого фицином, образующийся гиппурил-фиции не является таким устойчивым соединением, вступая в реакцию с водой [9].
Определить, какую долю концентрации фермента составит «выброс» «-нитрофенола в реакции гидролиза п-нитрофенилгип-пурата (10-4М) при следующих условиях эксперимента:
а) pH 5,9; начальная концентрация фицина 1,55-10—5 М; j%2=44 сек-1; k3=8,5 сек-1;
/Cs=2,8-10-4 М.
б) pH 3,9; начальная концентрация фицина 3,06-10-5М;
Ui=7,8 сек-1; й3=13,9 сек-1;
Ks=2-10~4М.
9-9. В таблице 8 приведены (л, см. рис. 92) n-нитрофенола в начальный период реакции эла-стазы с п-нитрофенилтриметилацетатом для ряда концентраций субстрата при постоянной начальной концентрации фермента [12].
Таблица 8
Зависимость «выброса» «-нитрофенола в начальный период ферментативной реакции (см. рис. 92) от начальной концентрации субстрата. Условия оыта: pH 7,9; 25° С
[ S 1„- 10s, М it-lO", м
3,00 0,797
5,81 1,215
8,57 1,344
10,28 1,480
Принимая, что механизм реакции согласуется со схемой (9.8), рассчитать начальную концентрацию активных центров фермента в растворе.
9-10. Кинетику гидролиза этилового эфира N-ацетил-Ь-трипто-фана, катализируемого а-химотрипсином, изучали в начальный период реакции с помощью метода «вытеснения профлавина» [5]. Было найдено, что уменьшение оптической плотности раствора во времени, соответствующее уменьшению концентрации комплекса фер «ент-профлавин, описывается кинетикой первого порядка с эф-
Время
Рис. 92. Определение «выброса» я продукта в начальный период ферментативной реакции
численные значения «выброса»
фективной константой скорости, зависящей от начальной концентрации субстрата (табл. 9). При изучении ферментативного гидролиза субстрата в стационарном режиме протекания реакции было найдено, что kKaT равна 2 сек^1. Из независимых экспериментов было также найдено, что значение константы диссоциации комплекса
Таблица 9 Значения эффективных констант скоростей первого порядка вытеснения профлавина из комплекса фермент-краситель при ацилировании фермента субстратом.
Условия опыта: pH 5,4; 28° С; начальная концентрация фермента 1-10~5М; начальная концентрация профлавина [F]c = 5-10-бМ
[S]o-103, М *эфф ' сек 1
0,50 13,0
0,61 14,5
0,75 17,0
0,90 19,9
1,45 28,0
1,77 32,0
2,25 38,0
2,70 42,0
фермент-профлавин при тех же условиях опыта равно 3,3-10-5 М. Принимая, что ферментативная реакция протекает по трехстадийной схеме, найти значения индивидуальных констант k2, k3 и Ks-9-11. Кинетику реакции а-химотрипсина с п-нитрофениловым эфиром М-ацетил-Ь-триптофана изучали методом. остановленной
Таблица 10
Зависимость эффективной константы скорости первого порядка выделения п-нитрофенола в начальный период реакции от начальной концентрации фермента [6|. Условия опыта: pH 3,5 ; 26,5° С; 1,6% ацетонитрила; ионная сила 0,05М; начальная концентрация субстрата
2 10- 6М
[E]o.10=, м кзфф' сек 1
1,38 1,8
2,13 2,6
3,00 3,6
4,40 4,7
5,15 5,3
5,95 6,0
8,50 7,8
11,60 10,0
16,60 11,1
струи. Было найдено, что образование n-нитрофенола в начальный период реакции в условиях [E]„»[S]o подчиняется кинетике первого порядка, причем эффективная константа скорости реакции зависит от концентрации фермента (табл. 10). Принимая, что изучаемая реакция проходит по трехе!адийной схеме, найти константы k2 и Ks-
9-12. Гидролиз этилового эфира N-ацетил-Ь-тирозина, катализируемый а-химотрипсином, изучали методом остановленной струи в условиях [S] 0^>[Е]0 по вытеснению профлавина из комплекса его с ферментом [7] (константа диссоциации комплекса фермент-профлавин в условиях эксперимента равна 4,4-10-5 М). Уменьшение оптической плотности раствора (Я=465 нм) во времени подчинялось кинетике первого порядка (табл. 11). Из кинетических
Таблица II
Значения констант скоростей вытеснения профлавина из комплекса его с а-химотрипсином под действием субстрата. Условия опыта: pH 5,0;
25° С; [EJC = 10_5М; начальная концентрация профлавина [F]0=5-10_5M; ионная сила 0,4М
[SJo‘103, М *эфф' сек 1
4,5 12
6,9 16
10,2 21
14,7 28
18,7 31
21,6 32
экспериментов, проведенных в стационарном режиме, было найдено, что значение каталитической константы ферментативной реакции равно 3,0 сек-1. Найти величины индивидуальных констант реакции k2, k% и Ks, если известно, что для изучаемой реакции выполняется условие k2^>k3 (см. схему 9.7).
