Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
[S]0 = [S] + [X1]+...+ [Х„] + [Р]. (9.4)
Так как система уравнений (9.2) содержит члены второго порядка k\ [Е]•[S] И А’—(п+1) [Е] • [Р] , она нелинейна и получить аналитическое решение данной системы при произвольных соотношениях констант скоростей реакций и концентраций реагентов не представляется возможным. Решения подобных систем уравнений могут быть найдены или путем численного интегрирования на цифровых вычислительных машинах [1] или моделированием па аналоговых вычислительных машинах [2]. Однако в некоторых частных случаях систему уравнений (9.2) можно превратить в линейную систему, которая может иметь аналитическое решение. В настоящее время при анализе кинетики ферментативных реакций, протекающих в нестационарном режиме, наибольшее развитие получили два подхода, основанные па предпосылках, упрощающих кинетическое рассмотрение:
а) предстационарная кинетика, или кинетика начальных стадий ферментативной реакции;
б) релаксационная кинетика, или кинетика смещения положения равновесия ферментативной реакции.
§ Т. Методы предстационарной кинетики
Одним' из вариантов упрощения системы дифференциальных уравнений (9.2) является использование большого избытка одного из реагентов (например, создание условий [S]0^>[E]0 или [Е]о^>
^>[S]o) и изучение кинетики реакции в начальный (прецстацио-нарный) период времени на небольшой глубине реакции. В этом случае накоплением концентрации продукта во времени можно пренебречь ([Р] «0), и члены второго порядка становятся зависимыми с достаточной степенью точности лишь от переменной концентрации одного реагента. Полученная таким образом новая система дифференциальных уравнений является линейной и имеет аналитическое решение. Так как для обработки экспериментальных данных имеется большое число вариантов применения методов предстационарной кинетики, анализ конкретных типовых ферментативных систем будет рассматриваться в решениях задач настоящей главы.
Кинетика ферментативных реакций в предстационарном режиме их протекания изучается в основном методами «остановленной струи». Принципиальная особенность этих методов состоит в быстром смешивании растворов реагирующих веществ в смесительной камере специальной конструкции [3, 4], после чего смесь поступает в измерительную кювету. Чаще всего в установках типа «остановленной струи» используется спектрофотометрический метод измерения с осциллографической регистрацией сигнала от фотоумножителя. «Мертвое» время лучших современных установок подобного типа составляет 0,1—0,3 мсек.
В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода «вытеснения профлавина». Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-хнмотрипсииом в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа «остановленной струи», вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции.
Если при изучении ферментативной системы, находящейся в состоянии равновесия, резко изменить внешние условия (температуру, давление), то равновесие в системе на некоторое время нарушается. В этом случае члены второго порядка системы уравнений (9.2)_?i [Е] • [S] и й_(ин)^Е] • [Р] принимают вид kx ([Е] +А[Е]) X X ([S] +AS) и ,([Е]+Л[Е])([Р]+Л[Р]), где [Е], [S] и [Р] -равновесные концентрации фермента, субстрата и продукта при исходном равновесии; Л[Е], A[S] и Д[Р] —переменные (зависящие от времени) концентрации реагентов при переходе системы к новому равновесию. Если сдвиг равновесия достаточно велик, то уравнения, описывающие поведение ферментативной системы, являются сложными, включая произведения переменных концентрации фермента и субстрата и опять приводя к нелинейной системе уразнений типа (9.2). Но при небольшом смещении равновесия эти произведения становятся пренебрежимо малыми, и члены второго порядка системы уравнений (9.2) приобретают вид
