Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
Время, мсек Оптическая плотность
раствора в относит, ед.
0 0,00
10 0,18
20 0,29
30 0,37
40 0,42
60 0,55
80 0,66
100 0,73
120 0,78
Со 1.00
9-4. а-Химотрипсин и N- (2-фурил) акрилоил-Ь-триптофан при низких значениях pH находятся в равновесии с ацилферментным соединением, N- (2-фурил) акрилоил-Ь-триптофанил-химотрипсином. Пли резком увеличении значения pH раствора (от 2,4 до 7,9) с помощью метода остановленной струи (так называемый «рН-ска-чок») наблюдается быстрое уменьшение оптической плотности раствора при длине волны 340 нм, соответствующее необратимому деацилированию ацилфермента (табл. 4). Определить значения констант скоростей ацилирования (k2) и деацилирования (k3) в
Таблица 4
Кинетика деацилирования
N - (2-фурил )акрилоил-1^-триптофанилхимотрипсина.
Условия опыта: pH 7,9 (трис-буфер 0,05М);
ионная сила 0,15; .25° С
Время, мсек Оптическое пропускание
раствора, %
10 47,5
20 48,9
30 50,0
40 50,8
50 51,8
70 52,9
90 53,2
СО 54,0
реакции гидролиза метилового эфира N-(2-фурил)акрилоил-L-триптофана, катализируемого а-химотрипсином (см. схему 9.7) при pH 7,9, если при этом значении pH величина каталитической константы скорости &кат, определенная в стационарных условиях, равна 25 сек-1 [11].
9-5. Реакция гидролиза n-нитрофенилтриметилацетата, катализируемого эластазой, протекает по следующей общей схеме:
E + S^ES-E + P2. (9.8)
Pi
На рисунке 91 приведен типичный пример кинетической кривой выделения «-нитрофенола (продукт А) в начальный период реакции. В табл. 5 приведена временная зависимость изменения разно-
Таблица 5
Кинетика ацилирования эластазы (1,86-10_6М) /1-нитрофенилтриметилацетатом (1,03- 10_4М) при pH 7,9 (см. рис. 91)
Время, мсек до
10 1,86-10---2
30 1,20-10---2
50 7,94-10~3
70 5,25-10~3
90 3,47-10~3
110 2,29-10-3
сти оптической плотности (AD) между наблюдаемой кривой и экстраполированным участком прямой, отвечающей стационарному режиму реакции в условиях [S] о^> [Е] о- Определить значение бимолекулярной константы скорости ацилирования фермента (/гц), если из кинетических экспериментов, проведенных в стационарном режиме, найдено значение &з=2,6-10_3 сек-1 [12].
9-6. Гидролиз о-нитрофенил-а-мальтозида, катализируемый а-амилазой, изучали с помощью метода остановленной струи. В табл. 6 приведена зависимость концентрации образующегося в реакции о-нитрофенола-от времени в начальный период реакции. Найти, двух- или трехстадийной схеме ферментативной реакции соответствуют данные табл. 6, если значения /Ст<каж) и /гКаТ, определенные в стационарном режиме протекания реакции, равны
8-10-4 М и 6,1 сек-1 соответственно [13].
Кинетика выделения о-нитрофенола в реакции гидролиза о-нитрофенил-а-мальтозида, катализируемого а-амилазой, в начальный период времени. Условия опыта: pH 5,3; 17° С;
[S]0 = 1,8510-3М; [Е|о = 1,710-4М
Время, мсек [Р, I-IOS м
10 0,725
20 1,450
30 2,180
40 2,900
50 3,630
60 4,350
70 5,070
80 5,800
so 6.520
9-7. При изучении начального периода гидролиза п-нитрофе-нилового эфира триметилуксусной киглоты, катализируемого эла-стазой (см. рис. 91), было найдено, что разность оптической плотности (AD) между наблюдаемой кинетической кривой и экстраполированным участком прямой, отвечающим стационарному периоду реакции, уменьшается со временем согласно кинетике первого порядка [12]. Было показано, чтс значение эффективной константы скорости реакции первого порядка зависит от начальной концентрации субстрата (табл. 7). Принимая, что ферментативная реакция протекает по схеме (9.8), определить значения констант ku и къ.
Таблица 7
Зависимость эффективной константы скорости первого порядка образования п-нитрофенола в реакции гидролиза
/1-нитрофенилтриметила иетата, катализируемого эластазой, от концентрации субстрата.
Условия опыта: pH 7,9; 25° С; [Е]0 = 1,86-10_6М
[SIo-105, м *эфф-1°3- еек 1
3,00 0,98
5,81 1,40
8,57 1,87
10,28 2,12
9-8. Один из методов расчета концентрации активных центров фермента основан на регистрации стехиометрического «выброса» первого продукта реакции (схема 9.7), если образующееся при
